Háromdimenziós szövettenyésztés

Átírás

1 Bartis, Domokos, PTE Általános Orvostudományi Kar Pongrácz, Judit, PTE Általános Orvostudományi Kar műszaki szerkesztő: Bencze, Zsolt, Csöngei, Veronika, Czulák, Szilvia felelős szerkesztő: Pongrácz, Judit, Bognár, Rita

2 írta Bartis, Domokos és Pongrácz, Judit műszaki szerkesztő: Bencze, Zsolt, Csöngei, Veronika, Czulák, Szilvia felelős szerkesztő: Pongrácz, Judit, Bognár, Rita Publication date 2011 Szerzői jog 2011 Pécsi Tudományegyetem Copyright 2011, Dr. Pongrácz Judit

3 Tartalom 1. Háromdimenziós szövettenyésztés Háromdimenziós szövettenyésztés (Tissue Engineering {TE}) alapvető ismeretek Sejtek és szövettípusok a TE-ben Őssejtek Őssejt-típusok Bioreaktorok A bioreaktorban használt sejtek típusai Bioreaktorok tervezési követelménye A bioreaktorok fő típusai A jelenlegi bioreaktorok hátrányai Bioanyagok Természetes bioanyagok Szintetikus bioanyagok Scaffold -ok készítése Scaffold -ok készítéséhez használt módszerek Biokompatibilitás Interakciók a scaffold -ok és a sejtek között Biológiailag aktív faktorok Fontosabb növekedési faktorok Növekedési faktorok adagolása Szabályozott hatóanyag-leadás Elterjedten alkalmazott növekedési faktor célba juttatási módszerek Bioaktív molekulák bejuttatása scaffold -okba Egyéb fehérje-leadó rendszerek a tissue engineering -ben Biodegradábilis és nem-degradálódó rendszerek Bioszenzorok Aggregátum kultúrák Aggregátum kultúrák típusai Természetes aggregátumok Szintetikus sejt aggregátumok Szövetnyomtatás Szöveti gyógymódok Transzplantálásra készített szövetek Kereskedelmi forgalomban lévő termékek Szív-érrendszeri betegségek Porc kezelésére készített termékek Májműködést segítő termékek Bőr sérülések terápiájához készített termékek Klinikai kipróbálás A klinikai kipróbálás típusai A klinikai kipróbálás fázisai Felnőtt őssejtek a szöveti terápiában Kísérletes felhasználás és drogtesztelés Példák a kutatásban használt aggregátum kultúrákra Etikai kérdések Gazdasági jelentőség Ajánlott irodalom iii

4

5 1. fejezet - Háromdimenziós szövettenyésztés 1. Háromdimenziós szövettenyésztés (Tissue Engineering {TE}) alapvető ismeretek Betegségek vagy mechanikai ártalmak által okozott szövetkárosodások a morbiditás és mortalitás gyakori okai. A szöveti sérülés gyógyulása általában beépített regenerációs mechanizmusokra vezethető vissza. Ha a sérülés túlságosan súlyos vagy a gyógyulási mechanizmus kóros irányt vesz, akkor gyakran csak a szervtranszplantáció lehet az egyedüli megoldás. A transzplantálható szervek hiánya súlyosa kihat a betegek életminőségére, és élettartamára, ezen kívül nagy szociális és anyagi terhet ró a társadalomra. A szöveti sérüléssel járó betegségek oki terápiájára csakis a célzott regenerációs vagy transzplantációs módszerek jelenthetnek végleges megoldást. A tissue engineering, tudományának célja, a szövetspecifikus folyamatok kutatása, és transzplantációra alkalmas szövetek előállítása. Eredetileg a tissue engineering -et a biológiai anyagtudományok és a mérnöki tudományok egyik mellékágaként határozták meg, de mivel az utóbbi időben ennek a tudományágnak mind a jelentősége mind pedig a művelőinek száma megnőtt, ma már önálló tudományágnak tekithető. A tissue engineering az emberi test egyes részeinek regenerálásával vagy újra-előállításával foglalkozik, különféle sejttenyésztési módszerek, biológiai anyagok, a megfelelő biológiai és biokémiai faktorok segítségével. Míg a tissue engineering definíciója a különféle módszerek nagyon széles skáláját foglalja magában, a gyakorlatban ez a tudomány szorosan összefügg a csont-, porc-, ér-, bőr- és más szövetek egészének vagy részeinek regenerációjával. I-1. ábra: A tissue engineering alapjai Az élő szervezeten kívül (in vitro) előállított szövetek gyakran embrionális vagy felnőtt sejtek felhasználásával készülnek. A mesterséges körülmények között előállított szöveteknek gyakran szükségük van mechanikai támogatásra és komplikált módszerek alkalmazására, hogy szerkezetük és élettani tulajdonságaik megközelítsék az élő szervezetben kifejlődött természetes szövetekét. Összetett szöveti szerkezet előállítására a hagyományos 2-dimenziós szövettenyésztési technikák nem alkalmasak. 1

6 I-2. ábra: Kétdimenziós szövetkultúra Az egyrétegű ún. monolayer kultúrákban a sejtek közötti kapcsolatok lehetősége korlátozott. Éppen ezért ezek a kultúrák nem alkalmasak komplex élettani funkciók ellátására. A tissue engineering -ben a hagyományos sejttenyésztési módszereket felváltotta a 3-dimenziós sejttenyésztés, mert így a sejtek alakja és élettani tulajdonságai közelebb állnak a természetes körülményekhez. I-3. ábra: Háromdimenziós szövetkultúrák 2

7 Ahogy a tissue engineering módszerek egyre inkább teret nyertek az orvosbiológiai kutatásban és terápiás lehetőségekben, egyre több szövettenyésztési módszer került kifejlesztésre. A 3D szövettenyésztési technikák során gyakran alkalmaznak különböző biológiai anyagokat, amelyek térbeli vázként szolgálnak a szövetet alkotó sejtek számára a bioreaktorokban. Ha a szövetek nem kerülnek azonnali felhasználásra, akkor mind a felnőtt primer sejtek, mind pedig az embrionális őssejtek hosszú ideig tárolhatóak -150 C alatt, folyékony nitrogénben. A következő fejezetek során rövid áttekintést adunk a tissue engineering -ről, érintve a különböző sejttípusokat, a felhasznált biológiai anyagokat, szövettenyésztési technikákat, és mindezek gyakorlati alkalmazási területeit. A tissue engineering módszerek klinikai kipróbálásai, valamint az etikai problémák is megvitatásra kerülnek a tananyagban. 2. Sejtek és szövettípusok a TE-ben Őssejtek A tissue engineering során többfajta sejttípust használnak, melyek több szempont szerint csoportosíthatóak. Differenciálódási állapot szerint mind az érett, differenciálódott sejtek, a köztes előalakok (progenitorok) és a differenciálatlan őssejtek alkalmazása megtalálható a különféle technikákban. Az utóbbi 2 típust lehet őssejtként definiálni. Az őssejtek differenciálatlan sejtek, melyek proliferációs képességüket sejtkultúrában megtartják, és különféle speciális sejtalakokká képesek differenciálódni. Az őssejtek forrásuk szerint 2 csoportra oszthatóak: felnőtt és embrionális őssejtekre. (II-1. ábra) II-1. ábra: Őssejttípusok Amíg a felnőtt őssejtek multipotensek, addig a legtöbb embrionális őssejt pluripotens, kivéve az egyedfejlődés legkorábbi stádiumában levő embrionális őssejteket (ami megfelel a megtermékenyített petesejtnek), amelyek totipotensek. Az őssejt niche -ek azok a speciális mikrokörnyezettel rendelkező helyek ahol az őssejtek az embrióban vagy a felnőtt szervezetben elhelyezkednek. Az őssejt sorsát a mikrokörnyezetből, a strómából érkező jelek határozzák meg. Az őssejtek a stimulustól függően kétféle módon osztódhatnak: szimmetrikusan, amikor is két ugyanolyan tulajdonsággal rendelkező leánysejt képződik, vagy aszimmetrikusan, amikor az egyik leánysejt örökli az őssejt tulajdonságait, a másik pedig érni, differenciálódni kezd. (II-2. ábra) 3

8 II-2. ábra: Az őssejt osztódásának típusai I. Az osztódások számának növekedésével párhuzamosan az őssejtek proliferációs képessége csökken, és előtérbe kerülnek a differenciáltabb fenotípusú sejtek. II-3. ábra: Az őssejt osztódásának típusai II. Ennek eredményeként a proliferációs szignálok folyamatos jelenléte az őssejt-állomány csökkenéséhez vezethet Őssejt-típusok 4

9 Embrionális őssejtek (Embryonic Stem Cells (ESC)): Annak ellenére, hogy az embrionális őssejtek alkalmazásának etikai kérdései folyamatosan napirenden vannak, ezen sejtek felhasználása a károsodott szövetek regenerációjára, új szervek/szövetek növesztésére vagy gyógyszerek tesztelésére intenzíven kutatott terület. A legfontosabb területnek emberi szervek vagy szövetek előállítását tartják transzplantáció vagy gyógyszertesztelés céljából, emberi őssejtek alkalmazásával. A humán sejtek alkalmazása különösen fontos, mivel a legelterjedtebb modellként alkalmazott rágcsáló-őssejtek másképp viselkednek, mint az emberi őssejtek, és más tenyésztési feltételeket igényelnek.. Nemrég fedezték fel, hogyha a rágcsáló embriókból korai blasztociszta-állapotnál később veszik ki az ún. epiblaszt-őssejteket (az embrió legbelsőbb sejtrétegéből, II-4. ábra) akkor ezek az őssejtek több tulajdonságukat tekintve jobban emlékeztetnek a humán őssejtekre, így bizonyos kutatásokban helyettesíthetik a humán őssejtek alkalmazását. II-4. ábra: Epiblaszt őssejtek Felnőtt őssejtek. A felnőtt vagy szomatikus őssejtek (II-5. ábra) minden szervben jelen vannak, mint például a csontvelő, bőr, gyomor- és bélrendszer, vázizomzat, agy, stb., (II-6. ábra) ahol a szövetspecifikus mikrokörnyezet megtalálható számukra, így ezek a sejtek képezik szöveti sérülés esetén az adott szerv regenerációs tartalékait. II-5. ábra: Felnőtt vagy szomatikus őssejtek 5

10 II-6. ábra: Hemopoetikus őssejtek Ahhoz, hogy a tissue engineering hatékony legyen, könnyű és gyors hozzáférés szükséges ezekhez a nagy osztódási kapacitású sejtekhez. Ezen felül szükséges az is, hogy megfelelő számban álljanak rendelkezésre az új szerv képződéséhez. A sejteknek/szöveteknek nem szabad kilökődési reakciót vagy malignus tumort kelteniük a recipiens szervezetében, és túl kell élniük a sebészeti beültetést követően előálló alacsony oxigénnyomású környezetet. Az érett, felnőttből származó sejtek nem teljesítik e kritériumokat, részben azért, mert az oxigénszükséglet párhuzamosan nő a metabolikus aktivitással. Miután ezeket a sejteket inkubátorban szaporították a beültetést megelőzően, viszonylag magas az oxigénszükségletük és a beültetés után nem viselkednek normálisan. Egy májsejtnek, például, ötvenszer nagyobb az oxigénszükséglete, mint egy porcsejtnek. Éppen emiatt fordult a kutatók figyelme az éretlen progenitorok és az őssejtek felé. A valódi őssejtek képesek mindenféle sejtté differenciálódni, míg a progenitorok már többé-kevésbé elkötelezett sejtek valamely szövetben, így csak az adott szövettípus sejtjeivé képesek differenciálódni. A szomatikus felnőtt őssejtek azok a progenitor sejtek, amelyek az adott szövet bármely sejtes alkotójává képesek átalakulni. Ha a szomatikus őssejteket akarjuk terápiásan felhasználni, a legjobb, ha autológ eredetű, saját, egészséges sejteket ültetünk be a recipiensbe, mivel a saját sejtek nem keltenek kilökődéshez vezető immunológiai reakciókat. Ugyanígy, azok a szervek, amelyek saját sejtek felhasználásával készültek, mentesek a fertőzés-átvitel kockázatától. Sajnos az autológ sejtek felhasználása kizárt genetikai betegségek esetén, nagy kiterjedésű sérülésnél (pl. súlyos, nagy testfelületet érintő égések) vagy nagyon idős beteg esetében, mert itt a proliferálódni képes sejtszám lehet korlátozott és a kinyert sejtmennyiség valószínűleg nem elegendő a regenerációs terápiára. További kockázatot jelent ezeknél a betegeknél az autológ sejtek felhasználása esetén a fájdalmas kinyerési módszer, valamint a kinyerési hely befertőződésének lehetősége, ami miatt az előny-kockázat arányt gondosan mérlegelni kell; hiszen maga a beavatkozás sikertelenségi esélye már kezdetben magas. Ezen felül a kinyert autológ sejtek tiszta populációjára van szükség a módszerek többségében és a terápiás alkalmazás előtt a megfelelő számban fel kell őket szaporítani. Mivel a tisztítás és a tenyésztés sok időt vehet igénybe, ezek a megoldások néha túl lassúak a hatékony terápiához. Az utóbbi időben terjedt el a zsírszövetben és a csontvelőben levő mezenchimális őssejtek (MSC) felhasználása terápiás célokra. Ezek viszonylag könnyen hozzáférhetőek, és többfajta sejt/szövettípussá képesek differenciálódni, például csont-, porc-, zsír-, és idegszövetté. Csontvelői őssejtek. A csontvelői őssejtek tovább oszthatóak strómális (endotheliális és mezenchimális) valamint hemopoetikus (vérképző) őssejt-vonalakra. Mindegyik őssejt-típus tisztán kinyerhető a csontvelőből a sejtfelszíni markermolekulák különbsége alapján. A csontvelői mikrokörnyezet fenntartásában mind a stróma mind pedig az őssejtek és különféle előalakok kölcsönösen részt vesznek; az őssejt-niche fennmaradásához szükséges ezen sejtek interakciója. 6

11 II-7. ábra: A csontvelői őssejtek interakciója a strómával A csontvelői őssejtek különféle szövetekké való differenciációs képességét a II-8. ábra foglalja össze. II-8. ábra: Egyes szöveti sejtek eredete a csontvelői őssejtekből Köldökzsinórvér-őssejtek. A regeneratív orvoslásban a leggazdagabb őssejtforrás, amit jelenleg is elterjedten alkalmaznak, a köldökzsinórvérben levő őssejtek. Ez nem meglepő, ha az évente születő mintegy 130 millió újszülöttet tekintjük. A köldökzsinórvért azonnal, születés után nyerik ki, és az őssejteket sejtfelszíni markerek alapján tisztítják, vagy tisztítás nélkül fagyasztják le a sejteket folyékony nitrogénben, DMSO hozzáadásával. 7

12 II-9. ábra: Köldökzsinórvér-őssejtek és magzati őssejtek II-10. ábra: Őssejt-típusok a köldökzsinórvérben A köldökzsinórvér-őssejtek transzplantációja esetén természetesen ugyanazok a szabályok érvényesek, mint bármely más szövet transzplantációja esetén: hacsak nem a korábban nyert autológ sejteket használják fel a későbbi regeneratív terápiára. Az utóbbi 36 évben több mint beteg több mint 80 fajta betegségét kezeltek köldökzsinórvér-őssejtekkel. Ideálisan a köldökzsinórvér-bank egy nemzetközi adatbázishoz csatlakozik és minden tárolt sejt HLA-tipizálásának adatai hozzáférhetőek. Sajnálatos módon az őssejtek tárolása meglehetősen költséges, így az őssejteknek ez a rendkívül egyszerűen hozzáférhető forrása nincsen a lehetőségekhez mérten kihasználva. Zsírszövet-eredetű őssejtek. Mostanában terjedt el a zsírszövetből izolált mezenchimális őssejtek alkalmazása. Ugyanúgy, ahogy más differenciálódott szövetek, a zsírszövet is tartalmaz zsírszöveti őssejteket (adipose stem cells, ASC). Ezeket az őssejteket könnyű izolálni (II11. ábra), multipotensek, konzisztens fenotípusos markerekkel rendelkeznek, és egyszerű a genetikai manipulációjuk. 8

13 II-11. ábra: Zsírszöveti őssejtek (ASC) izolálása II-12. ábra: ASC-k immunológiai fenotípusa Az ASC-k differenciációs potenciálja is meglehetősen széleskörű. A megfelelő faktorok alkalmazásával szívizomsejtek, harántcsíkolt izomsejtek, porcsejtek, csontsejtek, idegsejtek, endodermális és ektodermális sejtvonalak differenciáltathatók belőlük. Az őssejtek alkalmazása egyre széleskörűbbé válik, ahogy a sejtek növekedésének és differenciálódásának irányítására egyre tökéletesebb módszerekkel kontrollálható. 9

14 II-13. ábra: Embrionális és zsírszöveti őssejtek alkalmazása A sejteket mintegy újraprogramozzák, hogy az eredeti génexpressziós mintázat vagy a differenciáció a kívánt irányba módosuljon. Ehhez leginkább szolubilis citokinek, növekedési faktorok vagy sejt-sejt interakciók (pl. tápláló sejtréteg (feeder layer) alkalmazása szükséges. Természetesen e faktorok mibenlétét és az alkalmazás módját a klinikai vagy üzleti célú alkalmazás előtt pontosan azonosítani szükséges. A tissue engineering útján előállított szövetek laboratóriumi vagy klinikai alkalmazása nagyon szoros törvényi szabályozás alá esik. Az embrionális őssejtek alkalmazásán kívül GLP (Good Laboratory Practice) és GMP (Good Manufacturing Practice) minőségbiztosítási rendszernek megfelelő kipróbálási és gyártási körülmények szükségesek, ami ezeknek a szöveteknek a kifejlesztését és előállítását rendkívüli módon megdrágítja. Differenciálódott sejtek. A régi nézet, miszerint a felnőtt szövetek differenciálódott sejtjeinek proliferációs képessége nagyon korlátozott, mostanában megdőlni látszik. Ma már egyre több dedifferenciálódott sejtet alkalmaznak tissue engineering célra klinikai alkalmazások kereteiben. A sejtek dediffrenciálódása sok esetben úgy érhető el, hogy az izolált sejteket hagyományos 2 dimenziós módszerrel tenyésztik in vitro, ahol elvesztik eredeti differenciáltsági állapotukat. Gyakran felhasznált sejtek közé tartoznak a fibroblasztok, keratinociták, oszteoblasztok, endothel sejtek, pre-adipociták és zsírsejtek. A porcsejtek a leggyakrabban alkalmazott sejttípusok közé tartoznak. A következőkben a differenciálódott porcsejtek példáján keresztül mutatjuk be a differenciálódott sejtek tissue engineering célokra történő felhasználását. Az emberi porcsejtek izolálása invazív folyamat. A porcot meglehetősen fájdalmas bordabiopszia során, vagy egy nagyizület (leggyakrabban térd) nem terhelt felszínéről nyerik ki. Fontos, hogy a szervezeten kívüli porcsejt-tenyésztés során megfelelő számú egészséges porcsejtet nyerjenek a terápiás felhasználáshoz, ami gondot okozhat, ha a minta már eleve beteg porcból származik. Fontos, hogy a porcsejtek II-es típusú kollagént termelnek, amelyek a proteoglikán komponensekkel együtt 3 dimenziós hálózatot alkotva átszövik a hyalinporcszövet sejtközötti állományát, ezzel biztosítva a szövet mechanikai tulajdonságait, élettani terhelhetőségét. Növekedésben levő egyénekben a porcsejtek termelik az extracelluláris állományt, így terjesztik ki és formálják újra a porszövetet. Az öregedés során a porcsejtek e képessége csökken, csakúgy, mint a megfelelő proliferációs válaszkészség a növekedési faktorokra. Az öregedéssel összefüggő változások így csökkenthetik a porcsejtek képességét arra, hogy fenntartsák a porcszövetet, ami az ízfelszín degenerációját eredményezheti. A porcszövet regenerációjához felhasznált sejteket ezért megfelelő bioreakotrokban kell tenyészteni, hogy később a testsúly terhét viselő ízfelszínre megfelelő mechanikai tulajdonságokkal rendelkező szövetet lehessen beültetni. Annak ellenére, hogy a differenciálódott porcsejtek a tissue engineering útján előállított szövetek egyik legjobban felhasználható forrásai, manapság már szövettenyésztési módszerek autológ, minimális invazivitással járó és könnyen egyénre szabható megoldást kínálnak a sérült porcszövet regenerációjára. 10

15 3. Bioreaktorok A tissue engineering egyik legnagyobb problémája, hogy meglehetősen nehéz a beültetéshez elegendő mennyiségű és minőségű sejt vagy szövet előállítása. Általában nem megoldott a mesterséges körülmények útján előállított szövetek erezettsége (vaszkularizáció), így a nagyobb tömegű szövetek belsejének oxigén- és tápanyagellátása nem megoldott, így a sejtek funkciója is károsodik. Bár a spontán összerendeződés nagyon fontos szerepet játszik a különféle tissue engineering módszerekben, szükséges a beültetendő szövet növekedésének és differenciálódásának megfelelő irányítása. Ahhoz, hogy működőképes szöveteket állítsunk elő in vitro körülmények között, alapvető paramétereket, mint az oxigénnyomás, szén-dioxid-nyomás, ph, hőmérséklet, tápanyagok koncentrációja, ozmolaritás, stb. szoros kontroll alatt kell tartani a tenyésztés során. Ha a szövet szerkezete fontos a funkció szempontjából, akkor gyakran megfelelő szöveti vázak, ún. scaffold -ok alkalmazása szükséges. A tissue engineering útján előállított szövetek tenyésztés alatti fenntartása gyakran egyéb problémákat is felvet. Általánosságban, a molekulák diffúziója a tápanyagok és anyagcsere-végtermékek transzportjának egyetlen módja. Ha egy nagyobb kiterjedésű komplex szövet-konstrukció előállítása a cél, akkor el kell kerülni a központi területek nekrózisát. Fontos, hogy valamilyen kapilláris-hálózat kialakuljon a szöveten belül, amely lehetővé teszi a könnyebb tápanyag- és anyagcsere-termék transzportot. Hasonlóképpen, ahhoz, ahogy az őssejtek növekedését és differenciálódását irányítani tudjuk, az összetett szövetkultúrák számára is szükségesek a megfelelő fizikai, kémiai és biológiai stimulusok, hogy a kívánt funkciót megfelelően el tudják látni. Csak néhány példa: a porcsejtek normálisan is hipoxiás környezetben növekednek és differenciálódnak az élő szervezetben is. Más sejtek, pl. az endothel sejtek számára fontos a folyadékáramlás okozta nyíróerők jelenléte a differenciálódás során, amelyek fiziológiásan jelen vannak az erekben. A mechanikai ingerek, mint a ritmikus húzóerő jótékonyan hat mindenféle kardiovaszkuláris eredetű szövet differenciálódására, legyen az szívizomsejt, vérér, pericardium vagy szívbillentyű. A speciális bioreaktoroknak meg kell felelniük ezeknek a követelményeknek. A bioreaktor a tissue engineering -ben egy olyan készülék, amely képes a sejtek élettani környezetének szimulálására abból a célból, hogy a sejtek növekedését és megfelelő differenciációját serkentse. Az élettani környezetet többféle paraméter alapján lehet definiálni, ebbe beletartozik a megfelelő hőmérséklet, oxigén és szén-dioxid koncentráció, de kiterjedhet mindenfajta fizikai, (bio)kémiai és mechanikai stimulusra. Éppen emiatt, jelenleg rendelkezésre állnak olyan rendszerek, amelyek képesek 2- és 3-dimenzióban húzó vagy nyomóerő kifejtésére (például porc vagy szívbillentyű-konstrukciók előállításához). Jelenleg speciális bioreaktorok kaphatóak a kereskedelemre, melyek mind kutatási, mind pedig klinikai célú tissue engineering - re alkalmasak. Mindenesetre, a bioreaktorba való tenyésztéshez megfelelő számú sejtre van szükség első lépésben A bioreaktorban használt sejtek típusai A sejtek tenyésztése a hagyományos rendszerekben statikus körülmények között folyik. Ez a leggyakrabban alkalmazott módszer, olcsó, egyszerű, nem igényel különleges felszerelést vagy képzettséget. Általában üveg vagy eldobható műanyag edényekben petricsészékben, flaskákban, lemezeken folyik a sejtek tenyésztése. Alapvetően 2 típusú sejtkultúra van ilyen körülmények között adherens és szuszpenzióban növő sejtek. Mindkettő esetben az a legnagyobb hátrány, hogy az így elérhető sejtsűrűség meglehetősen alacsony. Éppen ekkor szembesülünk a tissue engineering legnagyobb problémájával, miszerint a beültetéshez nagyszámú sejt szükséges, amit a hagyományos sejtkultúrákban csak nagyon nagy mennyiségű sejttenyésztő folyadék alkalmazásával és annak gyakori cseréjével, valamint a sejtek gyakori passzálásával érhető el. Ezek mind időigényes, drága folyamatok és a gyakori médiumcsere és passzázs megnöveli a sejtkultúrák befertőződésének a veszélyeit. A dinamikus környezet sejttenyésztéskor azzal az előnnyel jár, hogy a tápanyag- és oxigénellátás folyamatos és dinamikus. Ezek a körülmények teszik lehetővé a nagyobb térfogatú 3D szövetkonstrukciók létrehozását, bár a transzport a szövet közepén levő sejtekhez még így is problémát okozhat. Míg a 3D szövetkonstrukciókban a sejt-sejt kölcsönhatások és kommunikáció fokozottan érvényesül, a tápanyagok és az oxigén eljuttatása a középen elhelyezkedő sejtekig állandó kihívást jelent az ezzel foglalkozó szakemberek számára. Először is, a nem mozgó, statikus folyadékból kell megoldani a szövet felszínén lévő sejtekig az oxigén eljuttatását. Ez összefüggésben van a sejttenyésztő folyadék oxigén-tartalmával és oxigén-szállító képességével. Az oxigén diffúziója a felszíntől a szövet közepéig szintén nagyon fontos. Ebben a tekintetben a 11

16 szövetkonstrukció vastagsága és porozitása bír kritikus fontossággal. Statikus kultúrákban a maximális szöveti vastagság kb. 100 µm, míg dinamikus tenyésztési körülmények között ez többszörösére nőhet Bioreaktorok tervezési követelménye Annak ellenére, hogy a bioreaktorok nem képesek 100%-osan reprodukálni a sejtek élettani környezetét, törekedni kell arra, hogy minél több paraméter egyezzen. A bioreaktoroknak serkenteniük kell az oxigén és a tápanyagok transzportját a 3D szöveti konstrukcióknál, és segíteni kell azt, hogy a sejtek eloszlása is egyenletes legyen a mesterséges szöveten belül, amelyet szintén serkent a dinamikus tenyésztési környezet megléte. A mechanikai stimulusok is fontosak olyan szövetek esetében, amelyek normálisan mechanikai terhelést kell elviselniük az élő szervezetben. Ilyenek például a csont-, porc-, izom-, ínszövetek, melyek mechanikus ingerek nélkül nem differenciálódnak megfelelően és beültetve nem fogják elviselni a mechanikus terhelést. A nyíróerő, mely szükségszerűen jelen van a dinamikus sejtkultúrában, szintén kritikus jelentőséggel bír. A sejtek érzékenyek a nyíróerőre, ez dedifferenciációt, növekedésgátlást vagy apoptózist okozhat. A nyíróerők eloszlása a bioreaktorokban egyenetlen, a legmagasabb nyíróerő a sarkok és az élek körül jelentkezik a dinamikus bioreaktorokban, mind az edényt, mind a szövetkonstrukciót tekintve. A nyíróerő mértékegysége a dyn/cm2, és emlős sejtek maximálisan 2,8 dyn/cm2 nyíróerőt képesek elviselni. Emiatt a jól megtervezett bioreaktorokban a maximális nyíróerő mindenhol jóval ez alatt az érték alatt marad. III-1. ábra: Nyíróerők dinamikusan mozgó folyadékban Talán a legnehezebb feladat a valós idejű információ kinyerése a szövet belső szerkezetének alakulásáról a bioreaktorban. Általában a tissue engineering -gel előállított szövetek cellularitása, belső szöveti szerkezete csak a tenyésztés után elemezhető részletesen. Általánosságban a bioreaktorok tervezésénél az egyszerűség és a könnyű tisztíthatóság elsődleges szempont, mivel így csökkenthető a fertőzés kockázata. Fontos, hogy a készülék össze- és szétszerelhetősége egyszerű és gyors legyen. Szintén figyelembe kell venni a tervezésnél, hogy a készülék sejtekkel érintkező része biológiailag inert vagy biokompatibilis anyagból készüljön. Például kerülendők a krómötvözetek vagy a rozsdamentes acél. Az anyagnak továbbá ellenállónak kell lennie alkoholos vagy hősterilizálással és az állandó magas páratartalommal szemben. Ezen felül biztosítani kell az olyan alapvető műszerek, mint a hőmérő, ph-mérő, pumpa vagy forgatómotor stb. beágyazását A bioreaktorok fő típusai Keverő bioreaktorok. A legegyszerűbb felépítésű és leggyakrabban használt bioreaktorok. 12

17 III-2. ábra: Keverő bioreaktor A keverő bioreaktorokban az oxigént és a tápanyagok egyenletes eloszlását az állandó keverés biztosítja, és csökkenti a szövetkonstrukció felszíne és a médium között kialakuló koncentrációgrádiens. A keverő bioreaktorban a scaffold -on tenyésztett szövetkonstrukciók a reaktortérbe belógó tűkhöz vannak rögzítve, míg a keverést egy mágneses keverőpálca végzi, így a folyadék van mozgásban a rögzített szövetkonstrukciókhoz képest. A scaffold -ok felszíne közelében mozgó folyadékban turbulens áramlás jön létre, amely a folyadék és a benne oldott részecskék megnövekedett rotációs impulzusa miatt növeli a transzportfolyamatokat a scaffold - ok belseje felé. Általában a kevertetett bioreaktorok térfogata 120 ml körül van, de a kereskedelemben kaphatóak jóval nagyobb, akár 8 literes térfogatú, hasonló elven működő bioreaktorok is. A kevertetés sebessége általában rpm körüli és átlagosan a médium 50%-át kell cserélni kétnaponta. A megnövekedett tápanyagtranszportot jellemzi, hogy a statikus kultúrában növesztett porcszövet-konstrukciók maximális gyzendő, hogy a kevertetett bioreaktorokban a sejtek egyenletes eloszlása a szövetkonstrukciókban nem jellemző, ennek a hatékonysága alacsony ebben a típusban; a sejtek leginkább a scaffold -ok perifériáján vannak nagyobb sűrűségben. A forgó bioreaktorokat (III-3. ábra) elsőként a NASA fejlesztette ki, abból a célból, hogy a sejttenyészeteket megvédje a magas gravitációs terheléstől, ami az űrhajó fel- vagy leszállásánál érheti őket. 13

18 III-3. ábra: Forgó bioreaktor A készülék földi használatban is hasznosnak bizonyult. A forgó bioreaktorban a scaffold -ok szabadon, felfüggesztés nélkül mozognak az edényben levő médiumban. Az edény nem más, mint egy hengeres edény, amely állandó szögsebességgel forgómozgást végez a hossztengelye körül. A forgás sebességét úgy kell megválasztani, hogy a folyadékban levő scaffold -okra felfelé ható hidrodinamikus felhajtóerő és a gravitációs erő egyensúlyban legyen. Ahogy az edény forog, az edény fala a folyadékra egy felfelé irányuló hidrodinamikus felhajtóerőt fejt ki, amely egyensúlyban van a lefelé ható gravitációs erővel, így a scaffold gyakorlatilag lebegve marad a folyadékban, miközben az élek mellett állandó lamináris áramlás van. Ez a dinamikus lamináris áramlás hatékonyan serkenti a tápanyag- és az oxigéntranszportot, ugyanakkor a scaffold -okra ható nyíróerők jóval alacsonyabbak, mint a kevertetett bioreaktorokban. A médiumcsere a reaktor ideiglenes megállításával szakaszosan vagy beszerelt pumpa segítségével folyamatosan is történhet. A forgó bioreaktorokban a transzportot segítő mechanizmusok hatékonysága hasonló, mint a kevertetett bioreaktorokban. A sejtek eloszlatása a scaffold -okon jóval egyenletesebb itt, mint a kevertetett bioreaktorban vagy a statikus kultúrákban. A gázcsere egy speciális membránon keresztül biztosított. A forgás sebessége általában rpm. A porcszövet ilyen tenyésztési körülmények között akár 5 mm vastagságúra is megnő, 7 hónap tenyésztési idő alatt. Megjegyzendő, hogy a szövetkonstrukció tömegének a növekedésével meg kell növelni a bioreaktor forgási sebességét, hogy a megnövekedet tömegre ható megnövekedett gravitációs erőt képes legyen ellensúlyozni. A kompressziós bioreaktorok (III-4. ábra) is elterjedten használt bioreaktorok. 14

19 III-4. ábra: Kompressziós bioreaktor Ezt a fajta bioreaktor leggyakrabban porcszövet előállításához használatos és mind statikus mind dinamikus nyomóerő (kompressziós erő) kifejtésére alkalmas. A dinamikusan változó nyomóerő az állandó nyomóerővel ellentétben a porcszövet kialakulására kifejezetten pozitív hatással van. Valószínűleg a dinamikus nyomóerőváltozások jól szimulálják a dinamikus élettani mechanikai stimulusokat, amelyek a differenciálódás alatt a porcszövetet érik. Általánosságban, a kompressziós bioreaktorok egy motorból és lineáris erőátviteli rendszerből állnak, amely beállítástól függően ellenőrzött nagyságú és frekvenciájú terhelés-impulzusokat képes kifejteni a scaffold -okon tenyésző szövetkonstrukcióra. Általánosságban, a kompressziós bioreaktorok egy motorból és egy jelgenerátor segítségével kontrollálható lineáris erőátviteli rendszerből állnak. A sejttenyészetre kifejtett erőhatás nagysága és frekvenciája transzformátorok segítségével mérhető. Az scaffold -okon tenyésző sejtekre az erőátvitel e legegyszerűbben sima felszínű lemezeken keresztül történik, így ez erőeloszlás is egyenletes. Mindenesetre, ha egy készülékbe több szövetkonstrukciót teszünk tenyésztésre, akkor ügyelni kell arra, hogy ezek magassága azonos legyen. A folyadékáramlás éppen a dinamikusan változó nyomási stimulus hatására jobb, mint statikus kultúrák esetén. A kompressziós bioreaktorokban tenyésztett mesterséges porcszövet mechanikai tulajdonságai és terhelhetősége hasonló lesz a természetes porcszövetéhez. A húzó-feszítő bioreaktorokat ín-, szalag-, szívizom-, csont-, és porcszövet előállítására fejlesztették ki. Néhány berendezés nagyban hasonlít a kompressziós elven működő bioreaktorokhoz, csak a scaffold -ra való erőátviteli módszer különbözik: itt nyomóerő helyett húzóerőt alkalmaznak. A nyomóerőt kifejtő lemezek helyett a scaffold -okat kapcsokra függesztik fel és így lehet húzó-feszítő erőhatásnak kitenni a szövetkonstrukciót. A húzóerő hatására a mezenchimális őssejtek porcsejt-irányú differenciálódást mutatnak. Húzó-feszítő bioreaktort alkalmazhatnak például porcszövet előállításakor. Ilyenkor a sejteket kollagénglükózamino-glikán scaffold -ra ültetve dinamikusan változó egydimenziós húzó-feszítő erőt alkalmaznak kapcsokon keresztül a szövetkonstrukcióra. Másik módszer ezeknek a bioreaktoroknak az alkalmazására, hogy a szövetkonstrukciót rugalmas gumimembránhoz csatlakoztatják, amely kapcsokkal van rögzítve az erőátviteli rendszerhez. Ilyen tenyészési rendszert alkalmaznak ínszövet előállításához, hogy az így elkészített mesterséges szövet Young-modulusa az élettani körülményekhez hasonlító legyen. (A Young modulus egy konstans, amelyet egy XVIII. században élt angol orvos-fizikusról neveztek el. A Young-modulus egy szilárd anyag rugalmasságára jellemző, ha csak egy irányú húzó vagy nyomó erőhatás éri.) A perfúziós bioreaktorokban (III-5. ábra) tenyészett szövetekre jellemző a homogén sejteloszlás a felhasznált scaffold -on. 15

20 III-5. ábra: Perfúziós bioreaktor Amikor csontvelői strómasejteket ültettek ki szivacsszerű kollagén scaffold -okra, a perfúzió hatására sokkal nagyobb sejtsűrűség elérése volt lehetséges, mint a hasonló tenyészetekben, amelyeket statikus körülmények között tartottak. Ez arra utal, hogy ezekben a bioreaktorokban a tápanyag- és oxigénellátottság jóval egyenletesebb a perfúzió miatt. Kalcium-foszfát scaffold -okon a sejtek nagy mennyiségű extracelluláris mátrix (ECM) komponenseket választottak ki és a kalcium-foszfát kis kristályokban rakódott le 19 nap után állandó perfúzió-sebesség mellett. A folyadéktranszportot tekintve a perfúziós bioreaktorok teljesítenek a legjobban összehasonlítva a kevertetett és forgó bioreaktorokkal. Ugyanolyan folyadékáramlási sebesség és sejtsűrűséget alkalmazva, a bioreaktor típusától függően nagy különbségek tapasztalhatóak a sejtek eloszlásának az egyenletességében. A statikus vagy kevertetett szövettenyészetekben a sejtek leginkább a szövetkonstrukció perifériáján koncentrálódnak, míg forgó vagy perfúziós bioreaktorokban a sejtek eloszlása sokkal egyenletesebb az egész scaffold -ban. A perfúziós bioreaktorok egy pumpából és egy hozzá csőrendszerrel csatlakoztatott szövettenyésztő kamrából állnak, ahová a tenyészteni kívánt szövetkonstrukciót helyezik. A pumpa átnyomja a szövettenyésztő folyadékot a porózus scaffold -on keresztül, amelyre a sejtek ki vannak ültetve. A scaffold rögzítve van a folyadék áramlásának útjában, így a szövettenyésztő médium gyakorlatilag átfolyik a scaffold pórusain, így biztosítva az egyenletes tápanyag- és oxigénellátást az egész térfogatban. A médiumcserét egy külső tartályból lehet biztosítani. A közvetlen folyadék-átáramoltatás hatásai nagyban függnek az áramlási sebességtől. Éppen azért, mert a különböző mesterséges szövetkonstrukciók tápanyagigénye és nyíróerő-tűrése más és más, a tenyésztési körülményeket előkísérletekben optimalizálni szükséges. Az áramlási sebességet úgy kell beállítani, hogy az egyensúly biztosítva legyen, a tápanyag-transzport és az anyagcsere-végtermékek eltávolítása között, a frissen szintetizált ECM komponensek helyben maradjanak és a megfelelő nyíróerő-szint legyen jelen a scaffold -on belül. Perfúziós bioreaktorok alkalmazása csontszövet előállításában. A sejtek egyenletes kiültetésére a perfúziós bioreaktorok hatékonyabbnak bizonyultak mind a kevertetett mind pedig a forgó bioreaktoroknál. A csontszöveti differenciációs markerek (alkalikus foszfatáz, oszteokalcin és a Runx2 transzkripciós faktor) következetesen magasabb szinten voltak jelen a perfúziós bioreaktorokban tenyésztett szövetkonstrukciókban, mint a másfajta bioreaktorban tenyésztetteknél. Ezen kívül itt a szervetlen anyagok lerakódása, a mineralizáció foka is nagyobb volt. Hogy a túl magas nyíróerők hátrányos hatását elkerüljük, nagyon fontos az áramlási sebesség gondos beállítása. Kísérletek igazolták, hogy az állandó áramlási sebességnél előnyösebb a dinamikusan változó, pulzálva áramló folyadék. Kétkamrás bioreaktor. A legutóbbi forradalmi újítás a mesterségesen előállított szövetek terén a tissue engineering segítségével előállított majd beültetett légcső volt. Ezt a konstrukciót egy speciális kétkamrás bioreaktorban állították elő. A donorsejtektől megtisztított (decellularizált) légcső külső felszínére a recipiens autológ porcsejtjeit ültették, amelyeket csontvelői őssejtekből differenciáltattak előzőleg. A decellularizált cső belső felszínére pedig saját légúti epitélsejteket ültettek. A cső elrendezése forgó bioreaktorhoz hasonlított, és az a megoldás, hogy a cső fala által elválasztott külső és belső tér nem kommunikált egymással, tette lehetővé a két 16

21 különböző típusú sejt kiültetését. Az így elkészített szövetkonstrukciót aztán egy tuberkulózis miatt légcsőszűkületben szenvedő betegbe ültették be A jelenlegi bioreaktorok hátrányai A jelenlegi tissue engineering módszerek rendkívül laborintenzív folyamatok, speciálisan képzett szakemberek tudják elvégezni ezeket a feladatokat. A mostani bioreaktorok nagyon speciális berendezések, bonyolult a szét- és összeszerelésük. A megfelelő számú sejt növesztése lassú és nem túl hatékony. Ezen kívül a bioreaktorban fejlődő szövet szerkezetének és más tulajdonságainak valós idejű monitorozása nem megoldott. Például, a kompressziós bioreaktorok esetében az egyik leggyakoribb probléma a szivárgás, mivel mozgó alkatrészeket tartalmaznak. Éppen a szivárgás miatt nő a befertőződés veszélye. A másik gond az alkalmazott scaffold minősége: a szövetkonstrukciónak ki kell bírnia a mechanikai nyomást, stimulációt. Éppen emiatt erősebb szerkezetű scaffold -ok szükségesek, amelyek degradációs ideje a szervezetben szükségszerűen hosszabb, ami természetesen lehetőleg kerülendő. Éppen emiatt kiegyensúlyozott kompromisszum szükséges a scaffold merevsége és a degradációs idő között. 4. Bioanyagok Mindenféle tissue engineering célra használt bioanyag szigorú követelményeknek kell megfeleljen. A biokompatibilitás az egyik legfontosabb tényező, mivel a scaffold vagy a bioreaktorok anyaga is szükségszerűen szövetbarát és sem válthat ki semmiféle immunológiai reakciót sem. Ezen felül még fontos, hogy a scaffold felszínén olyan kémiai csoportok, módosítások legyenek, amelyek lehetőleg támogatnak bizonyos sejtfunkciókat, mint letapadás (adhézió), differenciáció és növekedés. A porozitás is rendkívül fontos tényező a scaffold -oknál, ez biztosítja a sejtek egyenletes eloszlását kiültetéskor valamint a későbbi sikeres vaszkularizációt. Legjobb, ha a porozitás a 90%-ot túllépi. A szabályozott biodegradáció azt biztosítja, hogy a beültetett anyag fokozatosan lebomlik a recipiens szervezetében. A bioanyagok lehetnek természetes vagy szintetikus eredetűek Természetes bioanyagok A természetes bioanyagok (IV1. ábra) előnyei közé tartozik, hogy leginkább in vivo forrásból származnak, éppen emiatt általában viszonylag olcsóak és nagy mennyiségben állnak rendelkezésre. IV-1. ábra: Természetes eredetű bioanyagok További előnyeik közé tartozik, hogy mivel természetes eredetűek a biokompatibilitás általában nem okoz nagyobb problémát, és ezek az anyagok már eleve tartalmazzák a megfelelő biológiai kötőhelyeket a sejtek adhéziós molekulái számára. Természetesen hátrányok is akadnak; éppen az in vivo forrás miatt az egyenletes minőség biztosítása nehézkes, mindig van különbség a különböző sarzsok között és a mechanikai tulajdonságok is behatároltak. Másrészt a potenciális szennyezőanyagok nem kívánt immunológiai reakciót válthatnak ki és az ismeretlen kórokozók jelenléte soha nem zárható ki teljesen. A kollagén a leggyakrabban használt és éppen emiatt a legtöbbet tanulmányozott biológiai anyag. Gazdag in vivo források állnak rendelkezésre, mivel minden állati eredetű kötőszövet alapvető alkotója ez a mindenhol jelenlevő (ubikviter) molekula. A kollagén szálas szerkezetű, és az integrin adhéziós molekulák számára kötőhelyeket tartalmaz (ún. RGD motívumok, mely elnevezés az arginin-glycin-aszparaginsav egybetűs 17

22 rövidítéséből ered). Mivel a kollagén evolúciósan konzervált molekula, az immunológiai tolerancia magas szintű és a biokompatibilitás kitűnő. A sejtek differenciációját rendkívül sok irányban képes támogatni, éppen ezért a kollagén a scaffold -ok nagyon gyakori komponense. Másik könnyen hozzáférhető és nagy mennyiségben rendelkezésre álló scaffold komponens a fibrinogén. A fibrinogént (emberi) plazmából lehet izolálni. A hasítatlan formája vízoldható, ám thrombinnal hasítva a fibrinogén megalvad és olyan hidrogélt képez, amelynek nagyon komplex 3 dimenziós struktúrája van. A fibrinogén 100%-ban biokompatibilis mivel a sebgyógyulás élettani folyamatában is fibrinogén képződik. Gyakran használják is amolyan biológiai ragasztóként, amikor a sejteket scaffold -okra ültetik (pl. posztószerű biotextilekre vagy más porózus anyagokra). Ekkor a kiültetés előtt először fibrinogén-tartalmú oldatban szuszpendálják a sejteket, majd, a kiültetést követően thrombinos kezelés következik és a megalvadt 3D-szerkezetű hidrogél rögzíti a sejteket a scaffold -hoz. A fibrin támogatja az embrionális őssejtek differenciációját és a differenciálódott sejtek tenyésztését is. A fibrint jelenleg szív- és érrendszeri, porc, csont, és idegrendszeri szövetkonstrukciók előállításához alkalmazzák. A selyem, amely scaffold -ok anyagaként is használatos, egy fehérje, amely néhány ízeltlábú speciális mirigyében termelődik. Speciális harmadlagos szerkezete ismétlődő aminosav-motívumokból áll, amely átfedő béta-lemezszerkezetet képezve egyedülállóan magas szakítószilárdságot biztosít a selyemnek. Nagyon sok próbálkozás történt a selyemhez hasonlító anyagok ipari szintézisére; ennek eredményeképpen napjainkban egyre növekszik a rekombináns selyem-analógok száma. A selyemhernyó (Bombix mori) selyme 2 fehérjekomponensből áll, a fibroinból és a sericinből. Ez utóbbi adja a selyemszál külső burkolatát, ettől lesz a selyemszál csúszós és elasztikus. A fibroin biokompatibilis és kitűnőek a mechanikai tulajdonságai. Éppen emiatt a fibroint alkalmazzák scaffold -ként tissue engineering céljaira csont-, porc-, és ízületi szalagok előállításához. A fibroin kémiai módosítása lehetséges, pl. RGD motívumokkal, amelyek kötőhelyeket biztosítanak az integrinek számára és növelik a szervetlen kalciumsók lerakódását, valamit a csontsejtek differenciációját. Bár a selyem biodegradációja nagyon lassú, de végül csontszövet fogja elfoglalni a scaffold helyét. A fibroin ezen kívül előnyösebb tulajdonságokkal rendelkezik a kollagénnél a porcszövet képződésének serkentésében. A poliszacharid-alapú bioanyagok olyan polimerek, amelyek cukorszerű monomerekből állnak. Amelyek a tissue engineering célra használatosak, általában növényi (alga) vagy állati eredetűek. Mivel néhány poliszacharid nem kívánt immunreakciót válthat ki, ezért gondosan kell megválasztani a felhasznált anyagot. Általában a poliszacharidok hidrogél scaffold formájában használják fel, mert így önmagukban képesek 3 dimenziós hálózatot kialakítani és ezzel a kiültetett sejtek számára támasztékul szolgálni. Sokszor a hidrogélek injekció formájában kerülnek felhasználásra, így közvetlenül a sérülés helyére injektálják a hidrogélt önmagában vagy a belekevert sejtekkel együtt, így segítve a sebgyógyulást és a sejtek differenciációját. Az egyik leggyakrabban használt növényi eredetű scaffold anyag az agaróz, mely tengeri vörösmoszatból és más algákból kerül izolálásra. Az agaróz fő polimervázát galaktóz monomerek alkotják. Immunológiailag inert, nem vált ki nem kívánt immunreakciót. A legnagyobb előnye a felhasználási lehetőségek sokfélesége és a fizikai tulajdonságok rugalmas változtatásának a lehetősége: nagyon könnyen változtatható az agaróz gélek keménysége, porozitása. Az agarózt porc-, szívizom- és idegszövet előállítására használják, ezen felül támogatja az őssejt-differenciációt is. Az alginát a barnamoszatok poliszacharid sejtfalkomponense, savas kémhatású anyag, így leginkább kationos sók formájában kerül felhasználásra tissue engineering céljaira. A nátrium-alginát gyakran használatos az élelmiszeriparban állományjavítóként (E401) és a gasztronómiában is gyakran alkalmazzák. A nátrium-alginát másik felhasználási területe az iparban, hogy jól köti a zsírt és a nehézfémionokat. A kálium-alginát tulajdonságai és felhasználási területe nagyban hasonlít a nátriumsóéhoz, itt leginkább emulgeálószerként és stabilizátorként használják élelmiszeriparban. A tissue engineering -ben leginkább a kalcium-alginát használatos; mivel vízben oldhatatlan gélszerű anyagot hoz létre. Az iparban és kémiai laborokban a Ca-alginátot leginkább enzimek becsomagolására (enkapszuláció) használták, és ugyanígy alkalmas élő sejtek becsomagolására, amelyek így nem hozzáférhetőek az immunrendszer számára. Így az idegen sejtek rejekciója hatékonyan megelőzető és a transzplantált sejtek minden biológiai funkciójukat képesek ellátni. Hasnyálmirigy szigetsejteket csomagoltak be Ca-alginátba és így transzplantálták őket I-es típusú cukorbetegségben szenvedő betegekbe egy sikeresen záruló klinikai vizsgálatban. A sejtek életben maradtak, nem kerültek kilökődésre és az inzulintermelő képességüket is megtartották. 18

23 A hyaluronán vagy más néven hyaluronsav egy állati eredetű poliszacharid, mely elterjedten használatos scaffold -ok anyagaként tissue engineering célokra. A hyaluronsav egy szulfátcsoportot nem tartalmazó glükóz-aminoglikán, amely a sejtközötti állomány (ECM) egyik fő komponense a bőrben és a porcszövetben, de más szervekben is jelen van. Mint az ECM természetes makromolekuláris komponense, a biokompatibilitás adott, több kötőhelyet tartalmaz adhéziós molekulák számára. A hyaluronsav fontos szerepet játszik a sebgyógyulásban és a regenerációban, mitöbb, az embrionális őssejtek differenciációját, proliferációját és túlélését támogatja. A hyaluronsavat leggyakrabban hidrogél formájában alkalmazzák ideg-, porc- és bőrszövet előállításában. A chitosan állati eredetű poliszacharid, melyet az erősen kationos kitin deacetilálásával állítanak elő. A kereskedelemben kapható chitosant az állati planktont alkotó apró ízeltlábúak külső vázából állítják elő, leggyakrabban pedig sebkötöző anyagként használatos, mivel nagymértékben gyorsítja a véralvadást. A chitosan-alapú scaffold -ok leggyakrabban csontszövet előállításában használatosak, mivel ez serkentőleg hat az oszteoblaszt differenciálódásra. Ezen felül a chitosan-kálcium-foszfát kompozit anyagok könnyen formázható, injektálható anyagot alkotnak, ha a ph enyhén savas. Amikor a ph átmegy fiziológiás tartományba, akkor a gél mintegy megalvad, magába zárva a belekevert csontsejteket. Mind tiszta, mint kollagénnel kevert chitosan alkalmazható a csontszöveti tissue engineering -ben, mivel mindkét forma támogatja az oszteoblasztdifferenciációt Szintetikus bioanyagok A természetes eredetű bioanyagok mellett a tissue engineering -ben számos szintetikus bioanyag (IV2. ábra) is használatos. IV-2. ábra: Szintetikus bioanyagok fajtái A szintetikus anyagok legnagyobb előnye a minőség könnyű és következetes reprodukálhatósága, könnyű hozzáférhetőség és akár ipari mennyiség is termelhető belőlük. Kis változtatásokkal az összetételben a mechanikai, kémiai, biológiai, alaki és degradációs sajátosságok egyszerűen befolyásolhatóak az aktuális szükségletnek megfelelően. A hátrányok közé tartozik, hogy a szintetikus anyagokon alapvetően nincsenek a sejtadhéziót segítő molekuláris struktúrák és gyakran a biokompatibilitás és az őssejt-differenciálódást támogató képesség sem egyértelmű, azon kívül nem kívánt immunológiai reakciók is előfordulhatnak. Poli-(laktát-ko-glykolát) vagy PLGA az FDA által engedélyezett scaffold alapanyag. A PLGA egy kevert kopolimer, tejsavat és glykolsavat tartalmaz különböző arányokban. A PLGA degradálódik a szervezetben, amely degradáció sebessége könnyen befolyásolható. A PLGA a leggyakrabban használt scaffold alapanyagok egyike, alkalmazzák ideg-, csont és porcszövet előállításában. Biokompatibilis és nem írtak le nem kívánt immunreakciókat alkalmazásával kapcsolatban. Ezen kívül támogatja az őssejt-differenciációt, osztódást és túlélést is. Figyelembe kell venni a PLGA alkalmazásánál, hogy a degradáció során keletkező bomlástermékek savas kémhatásúak, ami befolyásolhatja a sejtek anyagcseréjét. A Polietilén-glikol (PEG) gyakran használt biokompatibilis polimer. A PEG amphofil, ami azt jelenti, hogy egy poláros fejcsoporttal és egy apoláros, változó hosszúságú farki résszel rendelkezik. A gyógyszeriparban meglehetősen elterjedt módszer a rekombináns fehérje-gyógyszerek PEG-iláció -ja, amellyel meghosszabbodik e fehérjék féléletideje a keringésben, mivel lassul a lebomlásuk. A PEG kémiai változtatása is gyakori, például heparinnal, peptidekkel vagy RGD motívumokkal. Gyakran alkalmaznak PEG-et csont-, porc-, ideg-, erek és májszövet előállításához. Nagyon rugalmasan alkalmazható különböző hidrogélek képzésére, könnyű kémiailag módosítani, és a gél paraméterei is széleskörűen változtathatóak: mindez nagyon széleskörű alkalmazást tesz lehetővé a tissue engineering területein. PEG alapú gélek nem csak sejtek lehorgonyzásához, hanem különb 19

24 A peptid-alapú bioanyagok rövid aminosav-szekvenciákból állnak, amelyek leggyakrabban amphofil tulajdonságúak, így spontán összeszerelődésre (self-assembly) képesek. A peptidek ilyen módú felhasználása képes ötvözni a szintetikus és a természetes anyagok előnyeit. A szintetikus úton előállított peptideknél nem merül fel a sarzsok közötti nagy különbségek kérdése és a tisztítás hiányosságaiból eredő problémák. Azon kívül a szekvenciába belefoglalhatók ismert aminosav-motívumok, amelyek a sejtadhézió szempontjából fontosak. Például a lamininból származó IKVAV szekvencia serkenti a neuritképződést, míg az RGD motívum biztosítja az integrinek kötődését, így serkentve a sejtadhéziót és vándorlást. Kerámia-alapú bioanyagok csakis a csontszövet előállításban használatosak. Ezek a scaffold -ok részben vagy teljesen szervetlen anyagokból állnak. Általánosságban porózus, hővel kialakított, törékeny anyagokról van szó. Például a bioaktív üveg lassan degradálódik az élő szervezetben. Ioncserélő mechanizmus útján lassan hidroxiapatittá alakul át, felszíni biodegradáció útján, így a bioüveg biokompatibilis és implantátumokban használatos. A hidroxiapatit a csont szervetlen alkotója. Néha csak magában, szerves komponens nélkül használatos, mit nagymértékben porózus anyag, gyakrabban azonban más, szerves komponensekkel kombinálják, mint például a kollagén, PLGA vagy a chitosan. Az ilyen scaffold -okba akár bioaktív anyagok is belefoglalhatók, így serkentve a csontképződést. A fémeket elsősorban implantátumokban használják. Általában alumínium vagy titánium-ötvözeteket használnak, mivel ezek biokompatibilisek. A fémek szívós anyagok, amelyek nagy mechanikai igénybevételt is képesek kibírni, ezért olyan területeken alkalmazzák őket, ahol nagy a fizikai terhelés (fogpótlás, ízületi protézis, műbillentyűk). Ezek a fémek általában biológiailag inertek, bár néha fémallergiás reakciók kialakulhatnak az arra érzékeny egyénekben. Mivel a fémek nem biodegradábilisek, ezért a scaffold -ként való felhasználásuk kétséges. 5. Scaffold -ok készítése A scaffold -ok már több alkalommal kerültek említésre az előző fejezetekben. Ezek természetes vagy szintetikus anyagok, amelyek mintegy vázul, állványzat -ként szolgálnak a 3 dimenziós szövetkonstrukciók számára. Van néhány alapvető kritérium a scaffold -ok tekintetében: a biokompatibilitás fontos, mivel a scaffold -ok nem válthatnak ki immunológiai reakciót, mert így a beültetett anyag csak krónikus gyulladást okozna. Az anyag felszínének kémiai tulajdonságai is nagy jelentőséggel bírnak: fontos, hogy a sejtek és a természetes ECM molekulák kapcsolatba tudjanak lépni a scaffold -dal. Mindenképpen szükséges, hogy a scaffold támogassa az olyan sejtfunkciókat, mint az adhézió és migráció. A scaffold -okra ültetett sejtek egyenletes eloszlását és a szövetkonstrukció beültetés utáni vaszkularizációját is biztosítani kell, éppen ezért a scaffold -nak sok egymással kapcsolatban levő pórust kell tartalmaznia, ajánlott a 90% feletti porozitás. A biodegradációs tulajdonságokat is figyelembe kell venni "scaffold"-ok esetében. Ideálisan, a scaffold lebomlik a recipiens szervezetében és helyét átveszi a sejtközötti állomány, melyet a beültetett vagy később odavándorló sejtek termelnek. Ha olyan szövetet állítunk elő, amely fizikai terhelésnek van kitéve (például csont- vagy porcszövet), akkor a scaffold mechanikai tulajdonságai különösen fontosak. Ellen kell állniuk a tenyésztés során például a kompressziós vagy húzó-feszítő bioreaktorokban keletkező erőbehatásoknak, és a röviddel a beültetés után keletkező mechanikai terhelésnek is. Az egyensúly azonban kényes ebben az esetben is, mivel az erősebb scaffold -ok degradációs sebessége lassabb. Sok scaffold -nál követelmény, hogy az anyagba gyógyszereket vagy más bioaktív molekulákat ágyazzunk be, melyek a degradáció során kontrolláltan szabadulnak fel a scaffold anyagából. Ezek gyakran növekedési vagy sejtdifferenciációt irányító faktorok, melyek serkentik az új szövet kialakulását. Fontos az is, hogy a scaffold interakcióba lépjen az ECM-el is, hiszen a degradáció során ezek a molekulák fogják betölteni a scaffold helyét. Fontos körülmény az is, hogy a beültetésig a scaffold fogja meghatározni a kialakuló szöveti struktúrát, a sejtek táplálását és a sejtek differenciációját is irányítani fogja, ebben a tekintetekben gyakorlatilag átveszi az ECM funkcióját Scaffold -ok készítéséhez használt módszerek Öntéses-kioldásos módszer (Solvent casting & particulate leaching, SPCL, V-1. ábra) a legegyszerűbb és legolcsóbb módszer a scaffold -ok készítésére. 20

25 V-1. ábra: Solvent casting & particulate leaching Gyakorlatilag az öntőformát megtöltjük valamilyen pórusképző anyaggal és a scaffold oldószerben feloldott anyagát beleöntjük a formába. Az oldószer elpárolgásával a scaffold megszilárdul, és a pórusképző anyagot ki kell oldani egy másik oldószerrel. Az SPCL technika egyszerű és olcsó, és nem szükséges speciális laboratóriumi eszköz vagy képzettség a végrehajtáshoz. Természetesen vannak hátrányai ennek a technológiának, a legnagyobb talán az, hogy a scaffold -ot alkotó polimert leggyakrabban toxikus szerves oldószerben oldják fel, amelynek a maradványait nehéz teljesen eltávolítani, így a kiültetett sejtek károsodhatnak a visszamaradó oldószer miatt. A fázis-szeparációs módszereket szintén gyakran alkalmazzák scaffold -ok készítésében. A scaffold alapanyagát feloldják két, egymással nem-keveredő oldószer keverékében, és ezután melegítés segítségével telített oldatokat készítünk. A magas és alacsony polimer-tartalmú fázisok elválnak egymástól magasabb hőmérsékleten, és a hőmérséklet csökkenésével a polimer kiválik a fázishatáron a túltelített oldatokból. Az oldószereket kivonással, elpárologtatással vagy szublimáció útján eltávolítják. Az így készített scaffold -okra jellemző az igen magas porozitás. A gáz-habosítás egy speciális technológia, amivel a szuperkritikus állapotban levő szén-dioxidot használják a scaffold elkészítésére. A módszer során speciális nyomásálló kamrába töltik a scaffold alapanyagát, általában granulátum vagy por formájában. Ezután a kamrát lassan megtöltik szén-dioxiddal, ami igen magas nyomáson eléri a szuperkritikus állapotot és folyadékként viselkedik szobahőmérsékleten. Ebben az állapotban a scaffold anyaga (részben) feloldódik a szén-dioxidban. Amikor a nyomást gyorsan csökkentjük a folyadékból hirtelen gáz keletkezik, és a fázishatáron kicsapódik a feloldott polimer. Tulajdonképpen a felszabaduló gázbuborékok mintegy felfújják a scaffold -ot, így különösen magas porozitású anyag érhető el, és további előny, hogy toxikus oldószer-maradványok miatt sem kell aggódnunk. Ezen kívül újabb kutatások szerint élő sejtek is képesek túlélni a módszerben alkalmazott extrém nyomásváltozásokat rövid ideig, ami a sejtkiültetést rendkívül hatékonnyá teszi. Az elektroszövés (electrospinning, V-2. ábra) nem csak scaffold -ok előállításában, hanem ipari szűrők gyártásában is gyakran alkalmazott módszer. 21

26 V-2. ábra: Elektroszövés A módszer lényege, hogy egy speciális injektor fecskendezi a feloldott polimert a levegőbe, míg az injektorral szemben egy elektromosan töltött lemezen gyűlik össze a kifecskendezett anyag, miközben a levegőben elpárolog az oldószer. A módszerrel egy nem-szövött szerkezetű, posztószerű struktúra jön létre, amelyet nagyon vékony szálak alkotnak. Az elektroszövés nagyon rugalmasan változtatható technika és nem szükséges extrém nyomás vagy hőmérséklet a szövet előállításához. A technika nagyon sokféle alapanyagú scaffold -ok előállításához alkalmazható, például PLA, PLGA, selyem fibroin, chitosan, kollagén, stb. További előny az is, hogy az így előállított textília paraméterei, mint pl. a szálvastagság, pórusméret, szálorientáció, stb. könnyedén szabályozható. A nem-szövött struktúrákon kívül szövött biotextíliák előállítására is van lehetőség (fiber-mesh technológia). Ez a technológia is széles alkalmazási lehetőségekkel bír, az így előállított scaffold -ok struktúrája szabályos, szövött szálakat tartalmaz, melyek anyaga, vastagsága, a szövés mintázata, a pórusnagyság is rugalmasan befolyásolható, és az így előállított anyagok mind 2D mind 3D szerkezete pontosan szabályozható. A spontán összeszerelődés (self-assembly) a molekulák spontán összeállását jelenti rendezett struktúrává. A tissue engineering -ben általában amphofil peptideket alkalmazunk, amelyek poláros fejjel és apoláros farokkal rendelkeznek, és képesek előre meghatározott struktúrákat kialakítani vizes oldatokban. Ezeknek a peptideknek a kémiai szerkezete kívánság szerint megváltoztatható: például foszfoszerin-csoport hozzáadása serkenti a mineralizációt csontszövet előállításánál, RGD motívumok segítik a sejtadhéziót, a ciszteinek keresztkötések kialakításával stabilizálhatják a szerkezetet, a GGG összekötő-motívum a feji és a farki rész között pedig a molekuláris szerkezet flexibilitását növeli. Az automatikus gyártási technológiákat összefoglalóan rapid prototyping -nek nevezzük, melyek előre programozott 3D szerkezetű séma alapján készítik el a megadott szerkezetű tárgyat additív technológiával. Ez a módszer nem csak az iparban alkalmazott, hanem használatos tissue engineering technológiákban scaffold - ok előállításához. Ezzel a módszerrel gyorsan lehet előállítani azonos minőségű, azonos szerkezetű, mintázatú scaffold -okat. A technológia hátránya, hogy speciális, drága számítógép-vezérelt készülék szükséges hozzá. Többfajta technológia tartozik az automatikus, komputer-vezérelt gyártási módszerek közé, például az FDM (fused deposition modeling). Ekkor egy robotikusan vezérelt gép egy polimer vagy más anyagból készült szálat tesz le a lerakófejen keresztül a beprogramozott minta szerint. A szálak egymás mellé- és fölé fektetésével 22

27 rétegenként alakítja ki a készíteni kívánt tárgy 3D szerkezetét a programozás szerint. Másik technológia az SLS (selective laser sintering, V-3. ábra) V-3. ábra: SLS technológia Ekkor a kicsivel az olvadáspont alatt tartott formázni kíván szilárd anyagból por vagy granulátum-formában egy réteget leterít. A komputer-vezérelt lézersugár a beprogramozott mintázat szerint végigpásztázza az anyagot, amely a lézersugár hatására megolvadva összeáll. A következő rétegekkel ugyanez történik, míg végül rétegrőlrétegre építkezve az anyag 3D szerkezete véglegesen kialakul a program szerint. 6. Biokompatibilitás Egy mesterségesen előállított szövet biokompatibilitása nagyban függ az előállításhoz felhasznált bioanyagok különböző körülmények között való viselkedésétől. Egy bioanyag akkor tekinthető biokompatibilisnek, ha az adott recipiensben az adott felhasználási körülmények között betölti a megfelelő funkciót. A biokompatibilis kifejezés más megadott információ nélkül arra utal, hogy az adott anyag bizonyos speciális tulajdonságokkal rendelkezik. Mindenfajta bioanyaggal kapcsolatban a következőekben felsorolt tulajdonságok szükségesek a biokompatibilitáshoz: a bioanyag vagy a degradációs termékei nem citotoxikusak, csak kismértékű vagy semmilyen immunreakciót nem vált ki, és képes integrálódni és együttműködni az adott típusú sejttel vagy szövettel. A meghatározás nem egyértelmű, ezért jól reflektál a bioanyagok és az emberi szervezet interakciójára, amely egyben meg is határozza az adott bioanyag felhasználásával készült szövetkonstrukciók klinikai alkalmazásának sikerességét. Mivel a tissue engineering -ben gyakran alkalmaznak különböző bioanyagokat scaffold -ok készítésére, a biokompatibilitás azt is meghatározza, hogy az adott anyag mennyire képes támogatni az adott sejt- vagy szövettípus funkcióit, a sejtszintű jelátviteli rendszerekre milyen hatással bír, tekintve a szöveti regeneráció számára optimális körülmények biztosítását és a helyi vagy egész szervezetet érintő káros hatások elkerülését is. Például, a minimális követelményeket tekintve egy érgraft biokompatibilitását nem csak az határozza meg, hogy képes passzívan a falai között tartani a vért, és nem kelt immunválaszt, nem okoz véralvadást, vérlemezkeösszecsapódást, komplement-aktivációt, hanem az is, hogy mennyire képes integrálódni a környező szövetekbe. Hasonlóképpen, annak a csontgraftnak, amit egy polimer scaffold -on készítettek, támogatnia kell a sejtnövekedést, ideiglenes mechanikai támasztékot kell nyújtania, hogy ellenálljon az in vivo fizikai terhelésnek, és olyan biodegradációs képességének kell lennie, hogy a scaffold megőrizze a fizikai tulajdonságait legalább 6 hónapig (4 hónap tenyésztés, 2 hónap beültetés után). Ezután pedig elkezdheti elveszíteni a fizikai 23

28 szilárdságát, de a degradáció során nem maradhat vissza idegen test és nem alakulhat ki toxikus vagy immunológiai reakció a beültetés helyén. A beültetési hely anatómiai és élettani viszonyainak megértése elengedhetetlen ahhoz, hogy a bioanyagot hatékonyan tudjuk felhasználni. További fontos paraméter a beültetés helyének pontos anatómiai viszonyainak feltérképezése. Az implantátumnak ugyanis formailag és funkcionálisan is tökéletesen illeszkednie kell az adott hely anatómiai viszonyaihoz, csak így lehet jótékony hatást elérni a tissue engineering segítségével. 7. Interakciók a scaffold -ok és a sejtek között A korábbi nézetek szerint a scaffold -ok csupán passzív komponensei voltak a mesterségesen előállított szöveteknek. Manapság ezek a nézetek megváltoztak; jelenleg az az elfogadott nézet, hogy a scaffold -ok funkcionális szempontból meghatározóak a szövetek előállításánál (VII-1. ábra és VII-2. ábra) VII-1. ábra: Sejtvonal tapad szorosan a scaffold felszínére VII-2. ábra: Alsó légúti hámsejtek Matrigel-ben Még akkor is, ha a scaffold csak megkötni képes 2 vagy többfajta sejttípust, ez egyedül is érdekes új tulajdonságokat hozhat elő. A scaffold -on egymás fizikai közelségében levő sejtek saját egyedi 24

29 mikrokörnyezetet alakítanak ki, ahol az egyes faktorok, szekretált bioaktív anyagok vagy adhéziós molekulák kölcsönhatása komplex, dinamikus sejtszintű változásokat eredményezhet. A tissue engineering -ben alkalmazott módszerek gyakran adnak lehetőséget olyan egyedi sejt-mátrix interakciók vizsgálatára, amelyek egyébként nem figyelhetőek meg. Ezek a megfigyelések olyan sejtszintű funkciókba adnak betekintést, amelyek hozzájárulhatnak, fontos felfedezésekhez vezethetnek a sejtbiológiában. Például egy ilyen kísérletsorozat alkalmával fedezték fel, hogy a harántcsíkolt izomszövetben levő kötőszöveti sejtek egy külön aktin-izoformát expresszálnak, az alfa-simaizomaktint, ami képessé teszi őket az összehúzódásra. Ez az információ megmagyarázhatja, hogy a sejtek hogyan képesek erőt kifejteni, amely szükséges bizonyos kóros vagy éppen élettani funkciók ellátásához. A tissue engineering tudománya és az ezúton in vitro előállított mesterséges szövetek nagyban hozzájárulhatnak a jelenlegi ismeretanyag növekedéséhez a sejt- és molekuláris biológia terén, ezen felül modellezési és terápiás lehetőségeket kínálnak egyes rendellenességekre, betegségekre. A mikro- és nanotechnológia gyors fejlődése és az ezzel a technológiákkal előállított scaffold -ok lehetőséget nyújtanak arra, hogy nagyon pontosan, előre definiáljuk az előállítandó szövet szerkezetét és így szabályozni tudjuk a sejtek térbeli elhelyezkedését az elkészítendő szövetben, amely nagyban hasonlíthat a természetes elrendeződéshez. A sejtközötti állomány (ECM) a sejtek természetes közege, amiben proliferálnak, differenciálódnak és mozognak. Az interakciók a sejtek és az ECM között kölcsönösen specifikusak és kétirányúak. Egyrészről, a sejtek szükség szerint, spcifikus jelekre válaszolva termelik, alakítják és lebontják az ECM-et, másrészről az ECM irányít egyes speciális sejtfunkciókat. A sejtek hozzátapadnak az ECM molekuláihoz speciális adhéziós molekulákon keresztül (integrinek) és ezek és más sejtfelszíni molekulák részt vesznek a jelátviteli folyamatokban is. Az ECM 3 dimenziós hálózata, amit különböző makromolekuláris elemek alkotnak, részt vesznek egyes bioaktív molekulák tárolásában, koncentráció-grádiensének kialakításában és felszabadulásának szabályozásában. Mivel az ECM fontos szerepet játszik a szöveti integritás fenntartásában, ezért a megfelelő keresztkötések kialakítása fontos lehet a mechanikai tulajdonságok javítása szempontjából. Az ECM molekuláinak keresztkötését olyan enzimek végzik, mint a Lizil-oxidáz (LO), szöveti transzglutamináz (ttg), vagy nem-enzimatikus glikáció útján, redukáló cukorcsoportok beépülésével is létrejöhet keresztkötés. A LO réziont tartalmazó oxidáz, amely főleg a kollagén és az elasztin lizin oldalláncainak oxidálásával hoz létre keresztkötéseket. A dezmozin, ami az LO-közvetítette lizin oxidáció végterméke, amely elasztinból keletkezik, általánosan használt markere az ECM keresztkötések kimutatásának. Az LO által katalizált keresztkötések a különböző kötőszövetekben ideértve a tüdőt, csontot, porcot és bőrt nagyban meghatározó tényezője a mechanikai ellenállóképességnek. Ezen kívül a keresztkötések lassítják a kötőszövet proteolítikus degradációját is. Az ECM rostjai oldhatatlan formában tárolják és segítik egyes biológiailag aktív faktorok felszabadulását úgy, hogy egyes glükóz-aminoglikánokhoz (például heparin) való kötődést segítik. 8. Biológiailag aktív faktorok Biológiailag aktív molekulák gyakran használatosak a tissue engineering -ben, így lehetséges olyan sejtfunkciók regulációja, mint a proliferáció, differenciáció, adhézió és mozgás (VIII-1. ábra). 25

30 VIII-1. ábra: Jelátviteli hálózatok a szöveti fejlődésben és homeosztázisban A leggyakrabban egyes növekedési faktorok használatosak, ideértve a sejtdifferenciációt segítő (például bone morphogenic protein, BMP) és az angiogenezist serkentő faktorokat (például Vascular endothelial growth factor, VEGF) is. A meglehetős nagymértékű redundancia az egyes biológiai rendszerekben olyan nagy mértéket ölthet, hogy nem lehetséges egyes faktorokat csak egyetlen kategóriába sorolni. Nagyon sok bioaktív molekula igen sokrétű funkcióval rendelkezik, amely függ a biokémiai, sejtes, illetve biomechanikai körülményektől, így ezektől függően különféle mértékben és irányban képes szabályozni a sejtek adhézióját, növekedését vagy apoptózisát, differenciációt, mozgást, érbenövést, stb. Mind a növekedési mind pedig a differenciációs faktorok nélkülözhetetlenek ahhoz, hogy a sejtek megfelelő szerkezetet és funkciókat sikeresen kialakítsanak. A növekedési faktorokat kívülről is hozzá lehet adni a rendszerhez, de az egyik sejtes komponens is termelheti valamilyen stimulus hatására. Annak ellenére, hogy a citokinek és egyéb szabályozó molekulák nagyon kis koncentrációban vannak jelen az ECM-ben, nagyon hatékonyan képesek befolyásolni a sejtek viselkedését. A leggyakrabban alkalmazott bioaktív molekulák a vaszkuláris endotheliális növekedési faktor (VEGF), a vérlemezke-eredetű növekedési faktor (PDGF), a keratinocita növekedési faktor (KGF), a transzformáló növekedési faktor-béta (TGF-β), a csont morfogenetikus protein (BMP) és a fibroblaszt növekedési faktor (FGF). Természetesen nem kérdéses, hogy ezek a molekulák biológiailag aktív koncentrációja más és más, az optimális dózis meghatározása nehézkes. Ezen kívül, ezeknek a faktoroknak állandó és helyhez kötött felszabadulása és annak a megoldatlansága, hogy ezeknek a faktoroknak az aktivitását ki-be kapcsoljuk a szöveti regeneráció során, nagyon megnehezíti a felhasználásukat. Ennek ellenére számos növekedési faktort tanulmányoztak különféle preklinikai kísérleti rendszerekben és klinikai kipróbálás során is, és ígéretes eredmények kerültek közlésre ezen a téren. A szöveti morfogenezis során az oldott állapotban levő növekedési faktorok irányítják a sejtek viselkedését. Ezek inaktív formában való szekvesztrációja az ECM 3 dimenziós hálózatában szükséges a gyors jelátvitel megvalósításához, ami lehetővé teszi a sejten kívüli jelátviteli molekulák élettanihoz hasonló sebességű hasznosítását. Ezen felül, mivel az ECM térben organizált, a szolubilis faktorok nem diffundálnak szabadon, hanem képesek koncentrációgrádiens kialakítására, amely rendkívüli jelentőséggel bír a szöveti morfogenezis, a vaszkularizáció, az idegi hálózatok és bizonyos progenitor sejtek differenciációja és mozgása szempontjából Fontosabb növekedési faktorok A BMP-család hasonló szerkezetű peptideket tartalmaz, amelyek a csontképződésben játszanak fontos, a differenciációs faktorokhoz hasonló szerepet. A BMP-k alacsony molekulatömegű (25 30 kda) glikoproteinek, amelyek csontszövet képződését okozzák, még akkor is, ha ektópiássan adagoljuk őket. Eddig a család több, 26

31 mint 15 tagját azonosították, mindegyik a csont- és porcszövet képződését és az ezeket felépítő sejtek differenciációját szabályozza. A különböző szabályozott folyamatok alatt értendő például az csontszövet képződésének indukciója, morfogenezise, kemotaxis, sejtvándorlás, sejtosztódás, vérképződés, sejtek túlélése illetve apoptózisa. A BMP-1 kivételével, melynek proteáz-aktivitása van, az összes BMP peptid a TGF-β szupergéncsalád tagja és nagy szerepet játszanak jó pár szervrendszer növekedésében és fejlődésében, mint például az agy, szemek, szív, vese, gonádok, máj, csontrendszer, harántcsíkolt izmok, szalagok és inak, valamint a bőr. Annak ellenére, hogy a család egyes tagjainak aminosav-szekvenciája meglehetősen nagy különbséget mutat, a szerkezeti hasonlóság mindenhol megvan. A BMP család tagjai tovább sorolhatók különböző alcsaládokba a törzsfejlődésnek megfelelően. A BMP-6 jellegzetesen fejlődő és szaporodó porcsejtekben expresszálódik az embriogenezis és a porcsejt- differenciáció során mind in vitro, mind in vivo körülmények között. A csontszöveti indukció során a BMP kemotaktikus faktorként szerepel, a sérülés helyére vonzva a progenitor- és őssejteket, ezen kívül növekedési faktorként is hatva serkenti az angiogenezist és az őssejtek proliferációját a környező mezenchimális szövetekben. A BMPk differenciációs faktorként is hathatnak, az őssejtek érését és differenciációját serkentik porc, és csontsejtekké valamint oszteoblasztokká. Az FGF-ek funkciója sem korlátozódik a növekedésre. Annak ellenére, hogy az FGF-ek serkentik a fibroblasztok proliferációját, az eredeti FGF-2 vagy bfgf az endothel-, porc-, simaizomsejtek, melanociták és más sejtek osztódását is serkenti. Az FGF-ek serkentik a zsírsejtek differenciációját, a makrofágok és fibroblasztok IL-6 termelését, asztrociták migrációját és megnövelik az idegsejtek túlélését. Az FGF-ek a sejtek proliferációjának, differenciációjának, mozgásának és túlélésének hatékony szabályozói, és olyan kulcsfontosságú folyamatokban játszanak fontos szerepet, mint az embrionális fejlődés, érképződés, csontképződés, porcképződés és sebgyógyulás. Az FGF szupergéncsalád 23 ligandból áll, amelyek 4 FGFR-hez kötődnek, melyek tirozin-kináz receptorok. A humán FGF-2 (más néven bfgf vagy HBGF-2 vagy EBGF) például 18 kda molekulatömegű nem-glikozilált polipeptid, amely bázikus lévén heparinhoz vagy heparánszulfáthoz kötődik nagy affinitással. Általánosságban az FGF-ek a szervezet különböző helyein tárolódnak, a GAG molekulákhoz kötődve, melyek megvédik őket az enzimatikus degradációtól vagy a savas inaktivációtól. A heparin ezen kívül növeli az FGF-2 mitogén aktivitását. A VEGF érképződést serkentő faktor, egyedülálló abban a tekintetben, hogy receptora csakis az endotheliális sejteken van, és az érképződés egyik leghatékonyabb stimulálója. A VEGF-et több normális és tumorosan átalakult sejtfajta termeli és termelődése összefügg a kapillárishálózat növekedésével embriogenezis, sebgyógyulás, tumornövekedés, és a női reprodukciós ciklus során. Ezen kívül a VEGF serkenti még számos angiogenezishez szükséges proteáz szekrécióját is a szövetekben. Természetesen minden mesterségesen előállított szövetben szükséges a VEGF termelés, amely serkenti az erek benövését a szövetkonstrukcióba az implantáció után, annak ellenére, hogy a VEGF mellett más faktorok, mint a PDGF, FGF-ek, TGF-β, HGF, és a PIGF is serkenti az erek növekedését. Amellett, hogy serkenti az endothelsejtek proliferációját és kemotaktikus hatással van rájuk, a VEGF növeli az erek permeabilitását is. A TGF-β szupergéncsalád prominens tagja a TGF-β1, amely 25 kda molekulatömegű növekedési faktor. Vérlemezkék és makrofágok a fő forrásai, de más sejttípusokban is termelődik ez a parakrin hatású molekula, mely fibroblasztokra, csontvelői őssejtekre, oszteoblaszt prekurzorokra van hatással. A TGF-β1 serkenti a kemotaxist és a sejtosztódást oszteoblaszt-prekurzorokban, serkenti a differenciációjukat érett oszteoblasztokká, serkenti a kollagénszintézist és az ECM lerakódását, gátolja a csontleépülést és az oszteoklasztok képződését. A PDGF dimer molekula, egymáshoz hasonló molekulatömegű láncokból áll (14 17 kda). Ez a sebesülés helyén elsőként szekretált növekedési faktor, mely a vérlemezke-aktiváció során szabadul fel. Nem csak vérlemezkékben, de makrofágokban és endothelsejtekben is szintetizálódik, és iniciálja a kötőszövet gyógyulási folyamatait, mint például a csontszövet gyógyulása és regenerációja. A PDGF befolyással bír a sejtosztódásra, vándorlásra, érképződésre, makrofág aktivációra és csontképződésre, proliferációra és matrix-szintézisre. A 4 PDGF izoforma (A, B, C és D) egy rendkívül konzervált 8 cisztein-tartalmú jellegzetes PDGF/VEGF homológ domént tartalmaz. A homo- vagy heterodimereket diszulfid hidak kötik össze, és a PDGF ligandok tirozin-kináz receptorokhoz kötődnek (PDGFR). A PDGFR-ok fontos szerepet játszanak a fehérjeszintézisben, kemotaxis gátlásában, embrionális idegrost-fejlődésben és a bronchusfa kialakulásában is. Osztódást serkentő hatásuk van az érfali simaizomsejtekre is Növekedési faktorok adagolása A növekedési faktorok használata in vitro rendszerekben nem mindig bizonyult sikeresnek. Nagyon gyakran ennek oka a kis molekulasúly miatti gyors diffúziójuk és a rövid féléletidő. A helyileg adagolt növekedési faktorok hatásideje rendkívül behatárolt, mivel eldiffundálnak, proteázok lebontják őket vagy a hordozóanyag 27

32 (például fibrin-ragasztó) idő előtt felszívódik. Emiatt a növekedési faktorokat megfelelő adagoló-rendszerekkel kell eljuttatni a célsejtig. 9. Szabályozott hatóanyag-leadás A biomolekulák vagy növekedési faktorok irányított célhoz juttatása, felszabadulása nagyon fontos a tissue engineering szempontjából, már csak azért is, mert ezek a biológiailag aktív molekulák képesek az adhézió, a differenciáció és a proliferáció szabályozására és így segítik a funkcionális szövet kialakulását. A szabályozott hatóanyag-leadásra képes rendszerekkel megoldható a növekedési faktorok hatásidejének elnyújtása és lokális koncentrációjának szabályozása. A scaffold -ok következő generációja nem csak a szövetkonstrukció megfelelő mechanikai és szerkezeti támogatására lesz képes, hanem aktívan szabályozza majd a sejtek differenciációját, proliferációját, adhézióját is. Ezt úgy lehetséges elérni, hogy a scaffold -ok funkciója kiterjed a biológiai jelek leadására is, melyek képesek a celluláris funkciók kívánság szerinti szabályozására a növekedési faktorok és más molekulák tárolásával és szabályozott leadásával, amely mimikálja az ECM élettani funkcióit. Többféle bioaktív anyag szabályozott leadásának képessége egy időben a sejtek viselkedésének tökéletesebb kontrollját és sikeres szöveti regenerációt tehet lehetővé. Jelenleg ennek lehetőségei még nincsenek meg a feladat bonyolultsága és a szükséges eszközök (kontrollált leadást lehetővé tevő anyagok és a rekombináns fehérje növekedési faktorok) költsége egyaránt magas Elterjedten alkalmazott növekedési faktor célba juttatási módszerek A fehérje injektálása. Ennek a módszernek az a hátránya, hogy a diffúzió és a fehérje degradáció miatt nagyon rövid ideig van jelen a növekedési faktor a hatékony koncentrációban. A növekedési faktort kódoló gén(ek) bejuttatása. Ez a leggyakrabban alkalmazott módszer a VEGF elválasztás megnövelésére a beültetett szövetkonstrukciókban. Ha a tisztított plazmid DNS-t juttatjuk be, akkor lebomolhat és a plazmid felvétele sem hatékony. Adenovírus vektorok nem épülnek be a genomba és leginkább hámsejtek transzfektálhatóak, a retrovírusok viszont csak proliferáló sejteket fertőznek meg, viszont beépülve a genomba a növekedési faktor szekréciója folyamatos. Lehetséges még géncsendesítés elérése is sirns vagy más oligonukleotid-konstrukt útján. A növekedési faktort termelő sejtek bejuttatása. Talán ez a megoldás a leghatékonyabb, ilyenkor már eleve genetikailag manipulált sejtek kerülnek kiültetésre a scaffold -ra, melyek folyamatosan és konstans mennyiségben képesek az adott növekedési faktor szekréciójára. A fehérje beágyazása kollagén vagy más porózus scaffold -ba. Ez a módszer lassú és folyamatos leadást biztosít a fehérjék és a növekedési faktorok számára. Állandó leadás ozmotikus pumpa útján. Ez a módszer meglehetősen egyszerű és olcsó, de a hatékonysága megkérdőjelezhető mivel a növekedési faktorok élettani szintje nem biztos, hogy elérhető ezzel a módszerrel. A fehérje kontrollált leadása biodegradálódó anyagba beágyazva (IX-1. ábra). 28

33 IX-1. ábra: Felszívódó polimerbe ágyazott fehérje kontrollált leadása Nagyon sok tanulmány foglalkozik a biológiailag degradálódó mátrixba ágyazott fehérjék kontrollált leadásának alkalmazási lehetőségeivel. Annak ellenére, hogy sokan bizonyították, hogy a polimerekbe ágyazott fehérjék biológiai aktivitása megmarad, nagyon sok bizonyíték utal a mégoly kis koncentrációban jelen levő szerves oldószerek a beágyazott fehérjék szerkezeti és funkcionális épségére gyakorolt negatív hatására. Fehérjéket egyébként adszorbeáltatni is lehet a scaffold felszínére, például szintetikus oligopeptideket, amelyek a fibronektin adhéziós szekvenciáját tartalmazzák. Azzal, hogy kémiailag módosított bionyagokat használunk a hatóanyagok kontrollált leadásához, jelentősen kiterjeszthetjük az így stimulált sejtek populációját és megnövelhetjük a hatóanyag felvételének hatékonyságát Bioaktív molekulák bejuttatása scaffold -okba Egyenletesen eloszlatott hatóanyagok. Nagyon gyakran a növekedési faktorokat vagy más hatóanyagot egyszerűen belekeverik a kontrollált leadást végző mátrixba. Ezek leggyakrabban hidrogél természetűek, és egyúttal scaffold -ként is szolgálnak a sejtek számára. Bizonyos körülmények fennállása esetén sejtek vagy bioaktív anyagok a gél megalvadása előtt belekeverhetőek a mátrixba. A beágyazott molekulák felszabadulásának sebessége és más jellegzetességei könnyen befolyásolhatók a keresztkötések számával, a felhasznált keresztkötő anyagok mennyiségével, pórusmérettel, stb. Szintetikus szilárd biodegradábilis anyagokat is teszteltek kontrollált leadás szempontjából különböző tissue engineering alkalmazásokban, leginkább nagyobb szilárdságú szövetekben, mint porc- vagy csontszövet. Annak ellenére, hogy elterjedten használják a szilárd scaffold -okat, sok kérdés merül fel a beléjük foglalt fehérjék leadásával és stabilitásával kapcsolatban. Éppen emiatt nagyon fontos a megfelelően kíméletes technológiák használata, mint a gáz-habosítás vagy az elektroszövés. Immobilizált jelátvivő molekulák. A polimer scaffold -ok olyan módon is előállíthatóak, hogy a kérdéses bioaktív jelátvivő molekulákat vagy növekedési faktorokat a scaffold anyagához hozzákötve azokat immobilizáljuk, így a diffúzió sebességét jelentősen lecsökkentve, a leadási idő megnyúlik. A jel immobilizálása lehetséges a molekula scaffold -hoz való reverzibilis vagy irreverzibilis kötődésén keresztül. Lehetséges az is, hogy egy degradálódó molekuláris linker köti a kérdéses molekulát a scaffold anyagához. Sok minden befolyásolhatja az immobilizált jelek leadásának/felszabadulásának profilját, például a kötőhelyek száma, a kötés erőssége vagy a scaffold degradációs sebessége Egyéb fehérje-leadó rendszerek a tissue engineering -ben 29

34 A hatóanyagok kontrollált leadására szolgáló technológiák nagy segítséget nyújthatnak abban, hogy biológiailag aktív scaffold -okat tervezzünk, amelyek alkalmasak arra, hogy alacsony vagy magas molekulatömegű fehérjéket szabadítsanak fel a lokális szükségleteknek megfelelően. Először is, a rendszernek megfelelő védelmet kell biztosítania a tárolt fehérje degradációja és inaktiválódása ellen, amely állandó probléma biológiai rendszerekben. Másrészt a kontrollált leadási rendszer alakjának, összetételének és szerkezetének a változtatásával a leadási paraméterek finomhangolása meglehetősen hatékonyan változtatható, amivel elérhetjük a leadott biomolekula lokális koncentrációjának a megfelelően hosszú időn keresztül való biztosítását. Ez a stratégia ezen felül alkalmas lehet egynél több fehérje kontrollált leadására is Biodegradábilis és nem-degradálódó rendszerek Egyszerű diffúzión alapuló nem-degradálódó platformok, mint például az etilén-vinil acetát kopolimerek (EVAC) és különböző szilikonok voltak az első ilyen célra alkalmazott platformok. Egyedül a pórusnagyság volt, ami a diffúzió sebességét szabályozta. Ma lehetséges sejtek beágyazása ilyen polimerekbe, ami képes hatékonyan megvédeni őket az immunológiai kilökődéstől. Biodegradábilis rendszerek. A leggyakrabban használt szintetikus anyagok a PLA és a PLGA, amelyek azért is használatosak nagyon széles körben mert a biokompatibilitásuk kiváló. Emellett még az összetételük, szerkezetük és ez által a degradációs tulajdonságaik is rendkívül egyszerűen befolyásolható paraméterek, úgyhogy a degradációs idő hetek és évtizedek között változtatható. Jelenleg a piacon többfajta PLGA formulációjú rendszer van jelen, (Lupron Depot, Sandostatin LAR Depot, Nutropine Depot és Zoladex ) és néhány sikeres növekedési faktor vagy más fehérje kontrollált leadása került leírásra az irodalomban. A poli-ortho-észterek (POE) új generációja került nemrég az érdeklődés középpontjába, ezek a polimerek injektálható, viszkózus bioanyagok, ahol a fehérje egyszerűen belekeverhető a polimerbe, hő és oldószerek alkalmazása nélkül. Az így kifejlesztett alacsony olvadáspontú polimer (POE IV) olyan hőmérsékleten formálható és injektálható, ahol a fehérje megőrzi biológiai aktivitását. A polianhidridek olyan biodegradábilis polimerek, melyek jelenleg intenzíven kutatnak új kontrollált leadási rendszerek tervezése tekintetében. Hidrofób gerinchez oldalláncok csatlakoznak hidrolítikusan instabil linkerekken keresztül. A PLGA-vel ellentétben a polianhidridekre elsősorban felszíni eróziós degradációs profil jellemző, amely jobban és egyszerűbben modulálható leadási profilt eredményez. On-off hatóanyag-leadási rendszerek. A fehérjék vagy peptidek kontrollált leadása olyan módon is megoldható, hogy meghatározott ritmusban, mintegy pulzálva történjen a kibocsátás, egy-egy adagot gyorsan kibocsátva hosszabb rövidebb leadási szünet után. Ezeket a rendszereket hívják programozott vagy indukált leadási rendszereknek. A programozott rendszerekre jellemző, hogy a leadás kontrollja teljes egészében belső szabályozó mechanizmuson keresztül szabályozódik, míg az indukált leadási rendszerek valamilyen külső szabályozás vagy inger hatására adják le a hatóanyagot. Ezek lehetnek például hőmérséklet, ph változás, elektromos vagy mágneses mező változása, ultrahang vagy besugárzás. A programozott leadási rendszerek esetében pontosan időzített hatóanyag-leadás történhet a polimer spontán hidrolízise vagy enzimatikus lebontása útján. A fehérje egy-egy adagjának kibocsátására tervezett, tömeg- vagy felszíni erózió útján degradálódó rendszerekben a PLGA, hidrogél, polianhidrid komponens(ek) összetételének vagy szerkezetének változtatásával lehet befolyásolni a kibocsátási paramétereket. 10. Bioszenzorok A bioszenzor definíció szerint a biológiai jelek átalakítására vagy detektálására, és detektálásuk megkönnyítésére szolgáló eszköz. A bioszenzor az eredeti jelre adott választ is kiválthat. A bioszenzor-fejlesztés komplexitása interdiszciplináris együttműködést tesz szükségessé az orvosbiológiai- és vegyészmérnökök, valamint a bioanyagok, a tissue engineering a polimer-tudomány, a kémia és patológia szakemberei között, hogy képessé váljanak hosszú működési idejű, beültethető bioszenzorok kifejlesztésére. A X-1. ábra modellezi a szövetek és bioszenzorok interakcióját. 30

35 X-1. ábra: Szövet és bioszenzor modellezése A bioszenzorok fejlesztésére irányuló kutatás egyik legfontosabb célja a megbízható glükóz-szenzor kifejlesztése, mely évekre teljesen beültethető a betegekbe. Eddig ezt még nem sikerült megvalósítani. Mindenesetre, hatalmas erőfeszítéseket tesznek a glükóz bioszenzor kifejlesztésére. Jelenleg a legígéretesebb próbálkozás a biomolekula-szenzitív hidrogél, egy olyan önszabályozó adagoló rendszer, amely reagálni tud specifikus fiziológiai stimulusokra, mint a glükóz vagy valamely enzim/protein koncentrációja. Más szavakkal, a hidrogélek bioszenzorként viselkednek. A glükóz hatására megduzzadó phszenzitív hidrogélek felfedezése óta a kutatás fókuszában a glükóz-érzékeny inzulinadagoló rendszer kifejlesztése áll. Az intelligens rendszer glükóz-oxidázból és telített inzulin oldatból áll ph szenzitív hidrogélbe zárva. A gélbe diffundáló glükózt a glükóz-oxidáz glükonsavvá alakítja, mely a gél duzzadását, következésképpen inzulin felszabadulást okoz. Hogy megbízható glükóz bioszenzort fejleszthessünk ki: (1) újfajta elektródákat kell kifejlesztenünk, melyek csökkentik a beültethető glükóz bioszenzor invazivitását; (2) bioaktív burkolat szükséges, hogy a beültethető glükóz bioszenzor in vivo élettartamát növeljük; (3) elektro-szövéssel előállítható nanofibrillumok szükségesek a bioaktív burkolat előállításához; (4) tanulmányoznunk és optimalizálnunk kell az élő szövet bioszenzorra adott válaszát; (5) serkentenünk kell az érújdonképződést a bioszenzor környezetében, hogy az érzékelés hatékonyabb legyen; (6) végül, újfajta bio-stabil porózus kollagén scaffold -ot kell kifejlesztenünk, hogy a bioszenzor szövetbarát legyen. 11. Aggregátum kultúrák Aggregátum kultúrák típusai Természetes aggregátumok Noha számos szövettípus kialakításához szükséges a scaffold rendszer, mint alapváz felhasználása a szövetek megfelelő formájának meghatározásához és ezzel a fiziológiás morfológia és funkció megalapozásához, az is nyílvánvalóvá vált, hogy a vázrendszer nem szükségképpen előre elkészített, hiszen azt a sejtek önmaguk is képesek ECM-et szekretálni, amiből a vázat kialakíthathatják. Ez a megfigyelés, illetve az, hogy a sejtek egymáshoz és számos felszíni struktúrhoz is tudnak tapadni, (XI-1. ábra) képezik a technológia alapját. 31

36 XI-1. ábra: Sejt adhézió Szuszpenziós aggregátumok. Számos más szövettípushoz hasonlóan, a kondrociták monolayer kultúrában dedifferenciálódnak, míg sejt-mátrix kapcsolatok, amelyek többszörös differenciálódási folyamatokat szabályoznak, képesek megőrizni a szövetek differenciáltságát. Szuszpenziós kultúrákban a fenotipikusan stabil kondrociták először ugyan diszpergálódnak a médiumban, de később aggregátumokat kezdenek kialakítani. Ez az aggregációs folyamat in situ interakciókat reprodukál, mivel a natív fenotípusú porcszövet jellemzői fenntarthatók aggregátum vagy üledék kultúrákban. A kondrocita aggregátum kultúrák specifikus molekuláris mechanizmusainak vizsgálata fényt derített mind sejt-sejt, mind sejt-mátrix kapcsolatokra az aggregátum kialakulása során. A molekuláris mechanizmusokról bebizonyosodott, hogy amíg (1) sejt-sejt kapcsolatok nem játszanak döntő szerepet, sokkal inkább (2) aggregáció II-es típusú kollagénhez és cartilage oligomeric protein (COMP)-ben gazdag mátrixhoz, és (3) β1-integrinhez, amely a kollagének hármas helikális GFOGER szekvenciájában található. β1 integrinről az is ismert, hogy II-es típusú kollagénhez tud kötődni, α1, α2, α10, vagy α11 β1 integrinekkel. A porc fejlődésében, homeosztázisának fenntartásában, degradációjában vagy a sejtek túlélésében a sejt-mátrix és a sejt-sejt kapcsolatok igen fontos szerepet töltenek be. Ezeket az interakciókat a végtag kezdemények mezenchimális sejt kondenzációja kapcsán alapos vizsgálatnak vetették alá, amely, mint a korai porcfejlődés, úgy tűnik, hogy sejt-fibronektin kapcsolatok által szabályozott. A kezdeti kondenzációs lépés után a sejt-sejt közötti kapcsolatok megerősödnek a homotipikus sejt adhéziós molekulák NCAM és N-cadherin segítségével. Az NCAM és N-cadherin aktivitás zavarai csökkent vagy megváltozott sejt aggregációhoz vezetnek mind in vitro, mind in vivo porcképződés közben. Később azonban NCAM és N- cadherin molekulák eltűnnek a porcszövetből és differenciált kondrociták nem expresszálják őket. Egészséges, felnőtt porcban nincs sejt-sejt kontaktus, sokkal inkább funkcionális sejt-mátrix kapcsolatok, azaz kondrocitaextracelluláris mátrix között létrejövő kötődés, amely integrinek által szabályozott folyamat. Érthető módon, az I-es típusú kollagén adagolása kondrocita szuszpenzióhoz növeli az aggregáció mértékét, míg kollagenáz alkalmazása gátolja. Gravitás aggregátumok (Függő csepp azaz Hanging drop (HD) kultúrák). Számos sejttípus in vitro aggregálására fejlesztették ki a függő-csepp kultúrákat (XI-2. ábra és XI-3. ábra). 32

37 XI-2. ábra: Mikrogravitás kultúra (Függő-csepp) I. XI-3. ábra: Mikrogravitás kultúra (Függő-csepp) II. Mikrogravitás kultúrákban sejteket egy csepp folyadékban tartanak, miközben a folyadék egy üveg fedőlemezen függ egy apró bemélyedés felett. Az ilyen kultúrák kivitelezésének segítésére fejlesztették ki a steril műanyagból készült plate-eket (Terasaki plate). A Terasaki plate-ek mind 60-lyukú, mind 72-lyukú l -nyi folyadékkal fejjel lefelé fordítva a plate-eket kialakulnak a függő-cseppek, melyeket a kapilláris hatás tart a műanyaghoz rögzítve. Egy ilyen folyadék cseppben a szuszpenzióban levő sejtek lassan szedimentálódnak és aggregátumot képeznek. Mivel a kicsi térfogatban a tápanyag mennyisége limitált, amint az aggregátum kialakult, a mikro-szövetet nagyobb szövettenyésztő edénybe kell áthelyezni. Embrioid testek (EB) készítéséhez mind a szuszpenziós, mind a függő-csepp aggregátum kultúrákat sikeresen alkalmazták. Enzimatikusan emésztett differenciálatlan, emberi őssejtek halmazaiból (hescs) embrioid testeket (EBs) 33

38 sikerült készíteni in vitro aggregációval. hesc-ek aggregációja lehetővé teszi a sejtek spontán differenciációját endodermális, mezodermális és ektodermális irányba. Az aggregációs módszerek lehetővé teszik növekedési faktorok exogén hozzáadását vagy különféle szabályozó gének túlexpresszáltatását a differenciáció megnövelésének és felgyorsításának érdekében. A hozzáadott faktorok közé tartoznak: hemopoetikus citokinek kombinációban mezoderma indukáló BMP-4-gyel, amely colony-forming unit (CFU) jelenlétében akár 90%-os tisztaságban CD45+ hemopoetikus sejtet tud kialakítani. Gravitás aggregátum II (Lecentrifugált aggregátumok). Hogy a sejtek közötti távolságot csökkentve az aggregátumok kialakulásának lehetőségét növeljük, tisztított sejttípusokból álló akár rágcsáló, akár humán sejt szuszpenziós kultúrákat összecentrifugálva képezhetünk szerv-aggregátum-kultúrákat. Az ilyen típusú aggregátum kultúrákat könnyű összeállítani, sejt összetételüket tetszés szerint lehet kiválasztani, a sejtek az aggregáció előtt manipulálhatók (gén expresszió módosítás, fiziológiás festés, stb), ezért ez a módszer kiválóan alkalmas kontrollált jelátviteli vizsgálatok kivitelezésére vagy patológiás folyamatok modellezésére és tanulmányozására Szintetikus sejt aggregátumok A szintetikus sejt aggregátumok fő koncepciója az, hogy polimer hidak segítségével kapcsolódjanak a sejtek egymáshoz, amelyek stabilizálják az aggregátumot (XI-4. ábra). XI-4. ábra: Szintetikus sejt aggregátum A polimert helyettesíteni lehet sejt adhéziós molekulákkal, ami a keresztkötés után segíti a sejt agglomerátumok kialakulását. Különféle anyagokat használnak a szintetikus sejt aggregáció kivitelezésére, köztük chitosan-t, módosított polietilén glikolt (PEG), lektineket és származékaikat, PLGA nanogömböket, stb. Sejtek kémiai keresztkötésére biotinilált sejt keresztkötő molekulákat is használnak (XI-5. ábra). XI-5. ábra: Biotinilált sejt keresztkötés Sejteket nagy sejtdenzitású szuszpenzióban lyukacsos vázra szélesztjük. A pórusokba szorulva a sejtek aggregációja megindul. Bioreaktorokban a médium mozgása elősegíti a tápanyagok és oxigén cseréjét, amely növeli az osztódást, melynek következménye a további sejt aggregáció. 34