A rekombináns humán erythropoietin-α fokozza a humán laphámrák sugárérzékenységét preklinikai modellben

Átírás

1 A rekombináns humán erythropoietin-α fokozza a humán laphámrák sugárérzékenységét preklinikai modellben Eredeti közlemény Lövey József 1, Kenessey István 2, Rásó Erzsébet 2, Dobos Judit 2,4, Vágó Ágnes 3, Kásler Miklós 1, Futosi Krisztina 2, Döme Balázs 4, Tímár József 2, Tóvári József 2,5 Országos Onkológiai Intézet, 1 Sugárterápiás, 2 Tumor Progressziós Osztály, 3 Központi Laboratórium, 4 Országos Korányi TBC és Pulmonológiai Intézet, 5 Semmelweis Egyetem I. sz. Patológiai és Kísérleti Rákkutató Intézet, Budapest Tumoros betegekben gyakran alakul ki anémia, amelyet különbözô rekombináns erythropoietinek (rhuepo-k) segítségével próbálnak korrigálni. A legújabb vizsgálatok azt mutatják, hogy az erythroid progenitor sejtek mellett a tumor- és endotheliális sejtek is expresszálnak erythropoietin-receptort (EPOR), ezáltal a rhuepo hatással lehet ezen sejtek funkcióira is. Munkánkban a rhuepoα-nak a sugárkezelés eredményességét befolyásoló hatásait vizsgáltuk EPOR+ humán laphámrák (A431) xenograft modellben. A tumort hordozó SCID egereket rhuepoα-val kezeltük humán-ekvivalens dózisban (150 IU/kg, három alkalommal hetente) a tumor oltását követôen. A xenograftokat a 14. napon besugaraztuk (5 Gy, amikor a tumor mérete elérte az mm 3 -t), majd a 22. napon megmértük a kialakult daganatok tömegét. A kísérletek alatt figyelemmel kísértük a rhuepoα általános hatásait, tekintettel a hemoglobinszintre, a tumor-asszociált erekre és a xenograftok HIF-1α-expressziójára. A rhuepoα-val és besugárzással kezelt A431 sejtek proliferációját, apoptózisát és kolóniaképzô képességét in vitro módszerekkel is vizsgáltuk. In vitro a rhuepoα-kezelés önmagában nem módosította az EPOR+ A431 sejtek proliferációját, viszont fokozta a sugárkezelés hatását az apoptózisra és a kolóniaképzô képességre. In vivo a rhuepoα-kezelés kompenzálta a tumor-indukált anémiát SCID egerekben és csökkentette a tumorális HIF-1α-expressziót, viszont nem volt hatással a tumor növekedésére. Mindeközben, a rhuepoα-kezelés szignifikánsan (p<0,05) növelte a sugárterápia hatékonyságát in vivo, a tumorerek roncsolásának fokozása révén. Megállapíthatjuk, hogy a rhuepoα-kezelés a daganat sugárterápiájának hatékonyságát nemcsak az általános hypoxia és a tumorális HIF-1α-expresszió csökkentésével módosíthatja, hanem a tumorerek nagyobb mérvû roncsolódásán keresztül is. Magyar Onkológia: 51:53 61, 2007 According to recent data erythropoietin receptor (EPOR) is expressed not only by bone marrow erythroid progenitors but by endothelial- and cancer cells and it was suggested that erythropoietin (EPO) may affect their functions as well. We have analyzed the effects of recombinant human erythropoietin-α?(rhuepoα) on radiation sensitivity of EPOR+ human epidermoid carcinoma (A431) xenograft model. In vivo rhuepoα treatment was started after tumor cell inoculation into SCID mice. 5 Gy irradiation was performed on day 14, the effect of which was measured on day 22. Hemoglobin level, tumor-associated microvessels and HIF-1α expression of the xenograft were monitored during the experiment. rhuepoα administration prevented the development of tumorinduced anemia of SCID mice and reduced the level of HIF-1α expression of the xenograft tumor without affecting tumor growth. We have found that rhuepoα treatment significantly increased the efficacy of antitumor effect of irradiation which was partly mediated by complex effects on tumorassociated microvessels. In vitro rhuepoα did not affect proliferation of A431 cells but enhanced the antiproliferative and proapoptotic effects of irradiation. We concluded that rhuepoα administration positively modulated the antitumoral effects of irradiation at least by two pathways, decreasing systemic hypoxia resulting in decreased tumoral HIF-1α expression and enhancing direct effects on tumor-associated microvessels. Lövey J, Kenessey I, Rásó E, Dobos J, Vágó Á, Kásler M, Futosi K, Döme B, Tímár J, Tóvári J. Human recombinant erythropoietin-α increases the efficacy of irradiation in preclinical model. Hungarian Oncology 51:53 61, 2007 Közlésre érkezett: január 22. Elfogadva: március 7. Levelezési cím: Dr Tóvári József, Országos Onkológiai Intézet, 1122 Budapest, Ráth György u Telefon: , Fax: , tozsi@oncol.hu A kísérletek a következô pályázatok támogatási keretein belül folytak: Oktatási Minisztérium NKFP-1a , valamint OTKA D és F MagyAR ONKOLÓGUSOK Társasága Magyar Onkológia 51. évfolyam 1. szám

2 Bevezetés Az anémia gyakran elôforduló jelenség daganatos betegek esetében; csökkenti az életminôséget és a kezelés kedvezôtlen kimenetelét okozhatja (8, 13, 38). Számtalan különbözô erythropoietikus hatóanyagot használnak a hemoglobinszint javítására (7, 35, 36), azonban ellentmondásos kísérleti és klinikai adatok állnak rendelkezésre a rekombináns humán erythropoietinek (rhuepo-k) alkalmazásával kapcsolatban. Sugár- vagy sugár- és kemoterápiában részesülô különbözô eredetû daganatos betegek rhuepo-kezelése vegyes eredményeket adott a kezelés kimenetele szempontjából: az EPO anémiát korrigáló és életminôséget javító hatása nem kérdéses emlô-, fej-nyaki-, illetve méhnyakrákban szenvedô betegek esetében, azonban a teljes túlélés nem javult (14, 18, 39), bár a méhnyakrákra vonatkozó adatok újabb vizsgálatokat igényelnek (6). Ugyanakkor petefészekés nyelôcsôdaganatok rhuepo-kezelésekor a teljes túlélésben javulás mutatkozott (26, 31). Az ellentmondásos eredményeknek köszönhetôen a legújabb áttekintô munkák arra a következésre jutottak, hogy a rhuepo-kezelés hatása a daganatos betegek túlélésére legalábbis bizonytalan. Számos kísérleti és klinikai eredmény gyûlt össze a tumorsejtek EPO-receptor- (EPOR) expressziójáról (1, 3), és az ezzel együttjáró fokozott daganatsejt-proliferációról, tumornövekedésrôl (4, 45). Mindemellett jól ismert, hogy az anémia és különösen a tumorszövetek hypoxiája csökkenti a kemo- és sugárterápia hatékonyságát (42). Számos adat azt mutatja, hogy szoros összefüggés van a hemoglobinszint és a daganatkezelés hatékonysága között: magasabb hemoglobinszint a tumor jobb oxigenációjához vezet, mely nagyobb mennyiségû aktivált szabadgyök képzôdését eredményezi a besugarazás után (12, 29, 43). Néhány adat azonban arra utal, hogy a tumorsejtektôl függetlenül, a tumoros erek sugárérzékenysége is lényeges eleme a sugárterápiának (24, 28). A besugárzás fokozza a hypoxia-indukálható faktor-1α-t (HIF-1α), mely a vaszkuláris endotheliális növekedési faktor (VEGF) és más angiogén faktorok overexpresszióját vonja maga után, ezáltal hozza létre az endotheliális sejtek fokozott sugárrezisztenciáját (11). Preklinikai vizsgálatokban VEGF-receptor-gátlószerek adása a sugárkezelés alatt fokozta a tumorkontrollt (46). Az eredmények alapján feltételezhetô, hogy a tumor érrendszere nemcsak a tumorszövet ellátásában kulcsfontosságú, hanem a sugárterápia eredményességét is befolyásolja. Jól ismert, hogy a rhuepo hatással van az endotheliális sejtek proliferációjára, apoptózisára és migrációjára, valamint hogy a rhuepo a VEGFhez hasonló hatású angiogenikus faktor (2, 17, 33). Korábban kimutattuk, hogy a rhuepoα adása preklinikai xenograft modellekben szignifikánsan növelte a tumor-asszociált endotheliális sejtek proliferációs indexét és a CD31-pozitív intratumorális erek méretét. A megnövekedett érfelszín emelte a tumorszövet perfúzióját, amely fokozta a kemoterápiás szerek daganatellenes hatásait (41). Jelen vizsgálatunkban a rhuepoα sugárkezelés eredményességét befolyásoló hatásait elemeztük in vitro és in vivo A431 humán laphámkarcinóma sejtvonalon és -xenografton. Anyag és módszer Sejtvonal A431 humán laphámkarcinóma-sejteket 5% foetalis borjúsavót tartalmazó DMEM médiumban (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) tartottuk fenn 37 o C-on 5% CO 2 -tartalom mellett. Tumorsejtek áramlási citometriája A sejtekbôl egysejtszuszpenziót készítettünk EDTA-val (Sigma), háromszor átmostuk szérummentes DMEM-mel, majd fixáltuk 20 percig metanollal. A fixálás után a sejteket blokkoltuk 3% BSA/PBS-sel (Sigma) 30 percig, aztán inkubáltuk anti-humán EPOR monoklonális antitesttel (1:20 PBS-ben, R&D Systems, Minneapolis, MN) vagy kontroll egér IgG2b antitesttel (Sigma). A kötôdött elsôdleges antitestet RPE-vel konjugált kecske anti-egér Ig-vel mutattuk ki (1:10 PBS-ben, DakoCytomation, Glostrup, Dánia). A jelölt sejtek fluoreszcenciáját CyFlow SLGreen áramlási citométerrel mértük (Partec, Münster, Németország) és a pozitív sejteket %-ban adtuk meg. Minden egyes kísérleti pontot három párhuzamosban teszteltük, és a kísérleteket legalább három alkalommal megismételtük. In vitro proliferációs teszt Kétezer A431 sejtet tettünk lyukanként 96 lyukú szövettenyésztô edénybe (Greiner, Frickenhausen, Németország) 5% szérumot tartalmazó médiumban, majd 24 órával késôbb humán rekombináns erythropoietin-α-val (rhuepoα, epoetinum alpha, Jannsen-Cilag, Shaffhausen, Svájc) kezeltük különbözô koncentrációkban (0,1, 1, 10 IU/ml) 72 órán keresztül 200 µl médiumban. A sugárkezelés sejtproliferációra gyakorolt hatásának detektálásához a szövettenyésztô edényeket besugároztuk (1,85 Gy/perc, összességében 5 Gy) 200 kv, 15 ma erôsségû terápiás röntgensugárzással (THX 250, Medicor, Budapest) 0,5 mm Cu filter használatával 6 párhuzamos lyukban. 48 órás inkubációt követôen 20 µl 5 mg/ml koncentrációjú metil-tiazol-tetrazólium-bromidot (MTT, Sigma) adtunk a sejtmédiumhoz 4 órára, 37 o C-on, majd a médiumot eltávolítottuk és a tetrazólium-kristályokat 100 µl DMSO-ban (Sigma) feloldottuk. Az abszorbanciát 570 nm-en ELISA Microplate Reader (Bio-Rad, Hercules, CA) segítségével mértük. Kolóniaképzô túlélési vizsgálat A431 tumorsejteket ( /lyuk, egyenként hozzávetôlegesen túlélô kolóniát hoznak létre a sugárkezelést követôen) 6 lyukú szövettenyésztô edényekbe (Greiner) juttattunk széru- 54 Magyar Onkológia 51. évfolyam 1. szám 2007 MagyAR ONKOLÓGUSOK Társasága

3 mot tartalmazó DMEM médiumban, és rhuepoα különbözô koncentrációival kezeltük (0,1, 1, 10 IU/ml). A sejteket 24 órával késôbb besugaraztuk (5 Gy) a rhuepoα-t tartalmazó médiumban, majd az edényeket 2 hétig 37 o C-on inkubáltuk. A kolóniákat 6 párhuzamos lyukban metanollal fixáltuk, Giemsa-val (Chroma, Köngen, Németország) megfestettük, és sztereomikroszkóp (MSZ5600, A. Krüss Optronic GmbH, Hamburg, Németország) alatt megszámláltuk. Az apoptotikus frakció detektálása A rhuepo-kezelt és besugarazott tumorsejteket 48 órás inkubáció után 0,02%-os EDTA segítségével felszedtük, PBS-sel átmostuk, majd 70%-os etanollal fixáltuk. A propidiumjodiddal és RNázzal (Cystain PI Absolute T, Partec, Németország) végzett 2 órás inkubációs periódus után meghatároztuk a sejtekben a DNS mennyiségét áramlási citométerrel (CyFlow, Partec). Az apoptotikus sejtek arányát a szub-g1 frakció mutatta ki, melyet FlowMax szoftver segítségével elemeztünk. A tumorxenograftok létrehozása A xenograftokat egysejtszuszpenziós oldatként 10 6 tumorsejt/0,1 ml szérummentes DMEM oldatban nôstény SCID egerek hátába történô szubkután oltással hoztuk létre. Minden állatkísérletet az Országos Onkológiai Intézet Állatgondozási és -Kezelési Bizottsága által jóváhagyott standardok és eljárások szerint végeztünk el. Hemoglobinszint mérése SCID egerekben Az egereket intraperitoneálisan Nembutal (Serva, Heidelberg, Németország) adásával elaltattuk, majd a szívbôl vért vettünk (a 8., 15., 18., 19. és 22. napon). A friss vért üvegcsövekben tartottuk 3,8% nátrium-citrát oldatban (citrát:vér arány=1:10 v/v). A mintákat 15 percig 4000 rpmen centrifugáltuk, és a hemoglobinszintet SYSMEX SF 3000 hematológiai mûszerrel határoztuk meg. In vivo EPO-kezelés és a tumorok besugárzása A tumort hordozó egereket rhuepoα-val kezeltük humán-ekvivalens dózisban (150 IU/kg fiziológiás sóoldatban, 0,1 ml végtérfogatban), heti 3 alkalommal intraperitoneálisan a tumoroltás utáni elsô naptól a sugárkezelés megkezdéséig (14. nap), amikor a tumor térfogata már elérte az mm 3 -t. Az állatokat altatás után rögzítettük, és a daganatot egy 1 cm 2 -es kör alakú terület középpontjába állítottuk. Egyszeri 5 Gy röntgensugárdózist alkalmaztunk lokálisan, egyenként létrehozott led árnyékolással, 200 kv, 15 ma-es terápiás röntgensugárforrás használata mellett (THX 250, Medicor, Budapest), 0,5 mm Cu filter alkalmazásával, 1,85 Gy/min dózisrátával. 8 napos inkubációt követôen az állatokat Nembutallal túlaltattuk és az eltávolított tumorok súlyát lemértük. A tumorerek immuncitokémiás vizsgálata A szubkután nôtt tumorokat összegyûjtöttük, formalinban fixáltuk és paraffinba ágyaztuk. Az immunhisztokémiai vizsgálatokhoz 5-7 µm vastagságú deparaffinált metszeteket használtunk. A metszeteket poliklonális nyúl anti-humán Factor VIII antitesttel (hígítás 1:20, Becton Dickinson Bioscience, San Jose, CA) inkubáltuk, amit biotinált anti-nyúl IgG és streptavidin-konjugált tormaperoxidáz (Vector Laboratories, Burlingame, CA) követett. Az ereket DAB kromogénnel tettük láthatóvá, a szövetszeleteket hematoxilinnel háttérfestettük. Metszetenként öt, egyenként 300x400 µm méretû élô tumorterületet fényképeztünk le és elemeztünk mikroszkóp alatt. A Factor-VIII+ erek morfológiáját 5-5 tumor 5 különbözô területén vizsgáltuk. Az érfal pericitáit anti-simaizomaktin antitesttel (SMA, DakoCytomation) történô immunhisztokémiai jelöléssel, AEC kromogénnel azonosítottuk. RNS-izolálás és reverz transzkripció A fagyasztva homogenizált mintákból a gyártó (TRI Reagent TM, Sigma) által megadott protokoll szerint össz-rns-t izoláltunk. A reverz transzkripciónál 2 µg tisztított RNS-hez 1 µl (10 mm) dntpmixet (Finnzyme, Espoo, Finnország), illetve 1 µl random primer-oligo dt-keveréket (mindkettô végkoncentrációja 2,5 µm) adtunk, és ezt az elegyet 10 percig 70ºC-on inkubáltuk. Szobahômérsékletre történt hûtés után a reakcióelegyhez mintánként 2 µl 10x M-MLV reverz transzkriptáz puffert (Sigma), 1 µl M-MLV reverz transzkriptázt (200 NE/µl, Sigma), 0,5 µl RNáz-inhibitort (40 NE/µl, Promega) és 6,5 µl DEPC-kezelt vizet adtunk. 37ºC-on 50 percig történt a reverz transzkripció, majd az enzimet 85ºC-on 10 percig inaktiváltuk. Az átírás megtörténtét (RT+ minták) és a DNS-szennyezôdés kizárását (RT- minta) β-aktin primerekkel (1. táblázat) végzett PCR segítségével ellenôriztük. Negatív kontrollként DEPC-kezelt víz szolgált. Primer jele (Génbank ID) Szekvencia (5-3 ) (lokalizáció) Termék β-aktin sense TCT GGC ACC ACA CCT TCT AC ( ) (gi: ) antisense CTC CTT AAT GTC ACG CAC GAT TTC ( ) 387 bp EPOR sense CATCAATGAAGTAGTGCTCCTAGAC ( ) (gi: ) antisense CCT CGT AGC GGA TGT GAG AC ( ) 131 bp HIF-1α sense AACTTCTGGATGCTGGTGATT ( ) (gi: ) antisense TGTTCATAGTTCTTCCTCGGC ( ) 339 bp 1. táblázat. A PCR reakciókban alkalmazott primerek ERYTHROPOIETIN-α HATÁSA A SUGÁRKEZELÉSRE Magyar Onkológia 51. évfolyam 1. szám

4 1. ábra. Az EPO-receptor expressziójának kimutatása mrns- és fehérje-szinten. (a) Az EPO-receptor (EPOR) detektálása RT- PCR segítségével. A humán-specifikus primerpár egy 131 bp nagyságú terméket amplifikált az A431 sejtekbôl (2-5) és a tumorxenograftokból (6-9) egyaránt. A primer specificitását mutatja, hogy sem egér izomból (10), sem egér bôrbôl (11) nem történt amplifikáció. Negatív kontroll: 12. (b) Az EPOR protein kimutatása áramlási citometriával; az eredményeket a pozitív sejtek százalékában fejeztük ki. Az EPOR expressziójának igazolása PCR segítségével A fenti átírásból származó cdns 2 µl-ébôl kiindulva végeztük a PCR-t. A 25 µl végtérfogatú reakcióelegy az EPOR-specifikus primereken (1. táblázat; végkoncentráció: 1 µm) kívül 2,5 µl 1,5 mm Mg 2+ - koncentrációjú PCR-puffert (DyNAzyme TM, Finnzyme), 2 µl dntp-mixet (2,5 mm, Finnzyme) és 0,4 µl DNS-polimerázt (2 NE/µl, DyNazyme TM, Finnzyme) tartalmazott. A PCR-feltételek a következôk voltak: 95ºC-on 2 percig történô aktiválást követôen 35 ciklus 94ºC 1 perc, 55ºC 1 perc, 72ºC 2 perc, amit egy 72ºC-on 10 percig tartó extenziós lépés követett. A PCR-terméket 2%-os agarózgélen választottuk szét, majd az eredményét etidiumbromiddal történt festést követôen a Gel Doc 2000 (Bio-Rad) rendszer segítségével dokumentáltuk. a b Number R FL1-Height epo FITC 1:10 --> HIF-1α-expresszió relatív mennyiségének mérése valósidejû PCR segítségével Az expresszált HIF-1α relatív mennyiségének meghatározását real-time PCR (MyiQ TM Single Color Real-Time PCR Detection System, Bio-Rad icycler) méréssel végeztük el. A 25 µl-es végtérfogatú reakcióelegy 12,5 µl 2x iq SYBR Green Supermix-et (Bio-Rad), 200 nm végkoncentrációban primereket (1. táblázat) és 11,5 µl hígított, a fenti átírásból származó cdns-t tartalmazott. A PCR-feltételek a következôk voltak: itaq DNSpolimeráz aktiválását (3 perc, 95 C) követôen 50 ciklus 95 C 30 mp, 55 C 30 mp, 72 C 1 perc lépésekkel. Pozitív kontrollként a hígítási sort is adó K562 humán leukémia sejtekbôl származó cdns szolgált, míg a negatív kontroll itt is a minták hígítására használt víz volt. Minden mintán mindkét PCR reakcióban (HIF-1α és β-aktin) 3-3 párhuzamos mérést végeztünk. A PCR-termékeket (autentikus termékméret alapján történô igazolásra) 2%-os agarózgélen megfuttattuk, majd etidium-bromiddal festettük. A felvétel rögzítését számítógéppel összekapcsolt Gel Doc 2000 (Bio- Rad) segítségével végeztük el. A HIF-1α relatív kiindulási mennyiségét K562 sejtekbôl származó cdns hígítási sorának (1x- 625x) HIF-1α PCR reakciója alapján nyert görbe, illetve a saját β-aktin-expresszióra történt normalizálás alapján végeztük el (az utóbbi alapja ugyanazon K562 cdns hígítási sor β-aktin PCR reakciója). A három párhuzamos mintán nyert mérési eredményt átlagoltuk. A minták HIF-1αexpressziójának egymáshoz viszonyított relatív arányát az eredménytáblázatban úgy számítottuk ki, hogy a legalacsonyabb expressziójú vonal mennyiségét vettük 1-nek, és a többi vonal normalizált kiindulási értékét ennek normalizált kiindulási mennyiségével osztottuk el. A PCR-termékek szekvenciájának meghatározása Valamennyi PCR-termék autentikus voltát szekvenálással igazoltuk. A PCR-termékeket az agaróz gélbôl High Pure PCR Product Purification Kit (Roche, Mannheim, Németország) segítségével nyertük vissza tiszta formában, majd a bázissorrendet ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA) segítségével határoztuk meg. Statisztikai elemzés Az in vitro kísérletekbôl és morfometrikus vizsgálatokból származó adatok összehasonlítása Student s t-teszt, míg az in vivo adatok elemzése a Mann-Whitney U-teszt alkalmazásával történt. A 0,05-nál kisebb p értéket tekintettük szignifikánsnak. Minden statisztikai elemzéshez CSTAT statisztikai programot használtunk. Eredmények Az EPO-receptor expressziója A431 sejtekben Az EPOR expresszióját mrns szintjének meghatározásával mutattuk ki RT-PCR technika segítségével mind az in vitro növekvô humán A431 sejtekben, mind az in vivo xenograft tumorokban. Az EPOR-ra specifikus primerpár mind a sejtvonalban, mind a xenograft tumorban a várt 131 bp hosszúságú terméket adta (1a. ábra), ezzel szemben az egér szövetekben (izom, bôr) nem történt amplifikáció, jelezve a primerek humán-specificitását. Az immuncitokémiai vizsgálatok azt mutatták, hogy az A431 sejtek több mint 50%-a expresszálja az EPOR fehérjét (1b. ábra). A rhuepoα in vitro hatása a tumorsejtek proliferációjára és a sugárkezelés eredményességére Bár az A431 sejtek kifejezték az EPOR-t, a rhuepoα-val 0,1-10 IU/ml dózistartományban 56 Magyar Onkológia 51. évfolyam 1. szám 2007 MagyAR ONKOLÓGUSOK Társasága

5 Napok a tumoroltás után Hemoglobin (g/dl) Kontroll 11,6±1,1 11,6±0,7 11,4±0,4 11,4±1,2 11,3±0,2 A431 11,3±0,5 10,9±0,6 10,4±0,5 10,1±0,5 A431 + rhuepo12,3±0,9 13,0±0,5* 12,4±0,4* 12,5±0,5* Átlag±SD (n=3), *p<0,05 a tumoros kontrollhoz viszonyítva 2. táblázat. A rhuepokezelés hatása a hemoglobinszintre A431 tumorxenograftok növekedése során 72 órán keresztül végzett kezelés nem mutatott szignifikáns hatást a sejtproliferációra (az adatot nem mutatjuk). A tumorsejtek besugarazása 5 Gy-vel 25,32%-kal csökkentette az élô sejtek számát 48 óra alatt. A rhuepo-kezelés (0,1-10 IU/ml) és a sugárkezelés (5 Gy) együttes alkalmazása további (<20%-nyi) proliferációgátlást eredményezett (2a. ábra). A rhuepoα hatása a tumorsejtek apoptózisára és kolóniaképzô képességére in vitro A rhuepoα-kezelés önmagában nem befolyásolta az apoptózist (a kontroll mintákban 1,6±0,3% volt az apoptotikus sejtek aránya, míg a rhuepokezeltekben 1,5±0,4%), viszont szignifikánsan (p<0,01) megnövelte az apoptotikus sejtfrakció mennyiségét a besugárzott tumorsejtekben. A sugárkezelés (5 Gy) önmagában ötszörös (8,4±2,1%), míg a rhuepoα-val (1 IU/ml, 48 óra) kombinálva közel 11-szeres (16,4±2,3%) növekedést eredményezett az apoptotikus sejtek arányában. Az A431 sejtek hosszú távú túlélésének tanulmányozása a kolóniaképzés vizsgálatával történt. Azt találtuk, hogy a rhuepoα koncentrációfüggôen (0, IU/ml koncentrációban) megnövelte a sugárkezelés hatását in vitro (2b. ábra). A sugárkezelés 60%-os csökkenést idézett elô a daganatsejtek klonogén túlélésében, melyet szignifikánsan tovább erôsített (8%, 30%, ill. 49%) a rhuepo-kezelés. A rhuepoα hatása a tumort hordozó SCID egerek hemoglobinszintjére A növekvô A431 xenograft anémiát idézett elô (hemoglobinszint <11 g/dl) a SCID egerekben a tumorsejtek szubkután történô beoltását követô 15. naptól (2. táblázat). Intraperitoneálisan rhuepo-t adtunk az egereknek humán-ekvivalens dózisban (150 IU/kg, 3 alkalommal hetente), az elsô naptól a kísérlet végéig (22. nap), mely csökkentette a tumor-indukált anémiát (2. táblázat, p<0,05). A rhuepoα hatása a HIF-1α mrns-szintjére A tumorális (humán daganatsejtek és a tumorstroma) HIF-1α expresszióját mrns-szintjének (339 bp hosszúságú termék) mérésével határoztuk meg a tumorxenograftokban az oltást követô 22. napon real-time PCR-rel. Az adatok azt mutatják, hogy a kontroll tumorokban a HIF-1α mrns-expressziója szignifikánsan magasabb volt (3,5-szörös), mint az rhuepoα-kezeltekben (3. ábra). 2. ábra. rhuepoα-kezelés hatása besugarazott tumorsejtek proliferációjára és kolóniaképzô képességére in vitro (a) rhuepoα-val kezelt A431 sejtek proliferációja egyszeri 5 Gy dózisú besugarazás után. *p<0,05 az egyedüli besugarazáshoz viszonyítva. (b) Besugarazott A431 sejtek hosszú távú (14 nap) kolóniaképzô képességének vizsgálata rhuepoαkezelés után. Átlag±SD, n=6; *p<0,01 az egyedüli besugarazáshoz viszonyítva a A kontroll százaléka b A kontroll százaléka Kontroll Kontroll 0,1 rhuepo 0,1 rhuepo * (IU/ml) 1 * (IU/ml) 3. ábra. Humán HIF-1α gén expressziója A431 tumorxenograftokban. A HIF-1α gén expresszióját real-time PCR-rel detektáltuk. A rhuepoα-kezelés szignifikánsan csökkentette a HIF-1α-produkciót. Átlag±SD, n=5; *p<0,05 a kontrollhoz viszonyítva Relatív expresszió Kontroll 1 rhuepo * 10 * 10 ERYTHROPOIETIN-α HATÁSA A SUGÁRKEZELÉSRE Magyar Onkológia 51. évfolyam 1. szám

6 A rhuepoα hatása a sugárkezelés antitumorális aktivitására in vivo A rhuepoα adása in vivo humán-ekvivalens dózisban nem volt szignifikáns hatással az A431 tumorxenograftok növekedésére (kontroll tumortömeg: 59,2±8,1 mg, rhuepoα-kezelt: 59,0±8,0 mg). A tumorok az oltást követô 14. napon 5 Gyes egyszeri besugárzást kaptak, mikor átlagos méretük elérte az mm 3 -t. Míg a sugárkezelés önmagában is szignifikáns gátlást eredményezett a tumor növekedésében (35,4±4,6 mg, p<0,01), addig a rhuepo-kezelés ezt a hatást szignifikánsan fokozta (24,2±5,3 mg, p<0,05). A rhuepo-kezelés és a sugárkezelés hatása a tumorok vérereire Az A431 tumorxenograftokban lévô mikrokapillárisokat humán poliklonális anti-von Willebrand faktor antitesttel jelöltük paraffinba ágyazott metszeteken morfometriai vizsgálatok céljából. Korábbi eredményeink szerint (41) a rhuepoαkezelt A431 xenograftokban az intratumorális mikrokapillárisok megnagyobbodtak, és az erek szabálytalan formát öltöttek (4a,b. ábra). A pericita-borítás, melyet simaizomaktin-immunhisztokémiával mutattunk ki, diszkontinuussá vált a tumorasszociált erek körül (4c,d. ábra). Az átlagos pericita-borítás morfometriai analízise több mint 30%-os csökkenést (p<0,05) jelzett. Összehasonlítva a kontroll tumorokkal, a sugárkezelés nagyobb érroncsolást végzett az élô tumorterületen belül a rhuepoα-val kezelt állatokban (5a, b. ábra). Az abnormális alakú, szétroncsolt tumorasszociált erek aránya több mint 50%-os volt a rhuepo-kezelt és besugarazott xenograftokban, szemben a kizárólag sugárkezelést kapott csoporttal, ahol ez 30%-nak adódott (5. ábra táblázata). Diszkusszió A hypoxia a szolid tumorok jellemzôje, és független prognosztikus faktorként szerepel a kedvezôtlen sugárkezelés kimenetelében és a túlélésben (13). Daganatos betegek esetében gyakran alkalmaznak különbözô rhuepo-kat a csökkent hemoglobinszint javítására. Az anémia hagyományos tüneteinek és ennek következtében az életminôségnek a javítása mellett (22) egy újabb észszerû oka van a rhuepo-k használatának: erôsítik a sugár- és/vagy kemoterápia hatékonyságát 4. ábra. rhuepoα-kezelés hatása a tumoros erekre A431 humán tumor xenograftban. Az ereket von Willebrand faktor elleni antitesttel jelöltük besugarazás elôtt a kezeletlen (a) és az rhuepoα-kezelt állatokban (b). Nyilak: nagyobb átmérôjû erek a rhuepoα-kezelt tumorokban; 200x nagyítás. c, d: Immunofluoreszcens jelölés az erek pericitaborításának kimutatására (simaizomaktin, piros) a kezeletlen (c) és az rhuepoα-kezelt állatokban (d) 22 napos xenograftokban (400x nagyítás). A folyamatos pericita-borítás megszakadt (nyilak) az rhuepoα-kezelt A431 tumorokban. a b c d 58 Magyar Onkológia 51. évfolyam 1. szám 2007 MagyAR ONKOLÓGUSOK Társasága

7 (23). Sajnálatos módon azonban az rhuepokezelések hatásairól szóló klinikai adatok ellentmondásosak. Számos pozitív eredmény (17, 37, 40) mellett az adatok egy jelentôs része azt jelzi, hogy a kezelés kimenetelére a rhuepo-knak kedvezôtlen hatása van (14, 21). Az ellentmondásosság egyik fô oka a tumorsejtek EPO-receptorexpressziója lehet. Egyes tumortípusok feltehetôen EPO-t, valamint EPO-receptort is expresszálnak (1, 3), ezért ez a citokin-szignálrendszer esetleg felelôssé tehetô a daganat növekedéséért (4, 45). Más vizsgálatok szerint a rhuepo-kezelés nincs hatással a tumorsejtek proliferációjára vagy in vivo növekedésére még az EPOR-t expresszáló tumorsejtek esetében sem (19, 25). In vitro és in vivo kísérleteinkben humán laphámrák-sejtvonal- (A431) és xenograft modellt használtunk. Ezek a daganatsejtek mrns- és protein szinten is kifejezik az EPOR-t. Humán-ekvivalens dózisban (1 IU/ml, vagy 150 IU/kg intraperitoneálisan 3 alkalommal hetente) adva a rhuepoα nem volt hatással a sejtproliferációra in vitro vagy a tumornövekedésre in vivo. A korábbiakban használt HT25 humán vastagbél-karcinóma sejtvonallal azonos eredményre jutottunk (41), alátámasztva mások adatait, miszerint nincs direkt összefüggés a tumorsejtekben meglévô EPOR és a rhuepoα adásánál néhány esetben tapasztalt fokozott proliferáció között (1, 4). A klinikai és preklinikai adatok arra engednek következtetni, hogy az EPO-k pozitív hatással vannak valamennyi tumorsejttípus esetén a sugárkezelés hatékonyságára, mely a tumor fokozott oxigenizációjára vezethetô vissza. Számos korábbi eredmény szerint a hemoglobinszintnek kulcsszerepe van a sikeres sugárterápiában (20, 32). SCID egerekben az A431 tumorxenograftok növekedése során a hemoglobinszint csökkent a tumorhordozó állatokban, hasonlóan a humán körülményekhez, a rhuepoα adása humán-ekvivalens dózisban azonban meggátolta ezt a csökkenést. A rhuepoα-kezelés az A431 xenograftok felerôsödött sugárérzékenységéhez vezetett, és a csupán besugárzást kapott egerekhez képest szignifikánsan kisebb tumorméretet eredményezett. A rhuepoα-kezelés jótékony hatása a sugárkezelésre in vitro is kimutatható volt. Az A431 sejtek in vitro rhuepoα-kezelése befolyással volt a besugárzás hatására, amely független volt az oxigenizációtól. A rhuepoα adása (1 IU/ml) kissé növelte a sugárkezelés (5 Gy) proliferációgátló hatását, szignifikánsan emelte az apoptotikus frakció mennyiségét és csökkentette az A431 sejtek kolóniaképzô kapacitását a besugárzást követôen. Ezeket a hatásokat in vitro kísérletekbôl ismertük meg, és részben magyarázhatják a rhuepo és a sugárterápia additív hatását in vivo, amikor a csupán besugarazottakhoz képest kisebb tumorokat észleltünk. Korábban eredményeink azt mutatták, hogy a rhuepoα adásával preklinikai modellekben szignifikánsan nôtt a tumorasszociált erek proliferációs indexe, mely nagyobb intratumorális erekhez vezetett. A megnövekedett érfelszín javulást eredményezett a kemoterápiás szerek tumorsejtekhez történô szállításában és fokozta azok antitumorális hatásait (41). Korábbi tanulmányok azt sugallják, hogy a rhuepoα adása javítja az oxigenizációt az élô tumortömegben, függetlenül a hemoglobinszinttôl (5), így a tumor oxigenizáltsága növekedik a fokozott tumorperfúzióval. Jól ismert, hogy az endotheliális sejtek EPOR-t expresszálnak, és a rhuepo befolyásolja a proliferációjukat, apoptózisukat és migrációjukat (2, 33). Sôt, a VEGF-hez hasonlóan a rhuepoα is egy angiogenikus faktor (17). Ahogy azt korábban már leírták, a sugárkezelés tumorellenes mechanizmusában kulcsfaktor az anti-angiogenikus ha- 5. ábra. rhuepoα-kezelés és a besugarazás hatása a tumoros erekre A431 tumorxenograftban. Az ereket von Willebrand faktor elleni antitesttel jelöltük besugarazás után a kezeletlen (a) és a rhuepoα-kezelt állatokban (b). Nyilak: roncsolt erek a besugarazás után (200x nagyítás). Táblázat: a roncsolt erek mennyiségi kiértékelésének eredménye; *p<0,05 a kontrollhoz, **p<0,05 az egyedüli besugarazáshoz viszonyítva a b Kontroll rhuepoα Sugárkezelés Sugárkezelés + rhuepoα A roncsolt erek százaléka 4,3±0,3 6,6±0,4 30,0±8,7* 52,4±8,8** ERYTHROPOIETIN-α HATÁSA A SUGÁRKEZELÉSRE Magyar Onkológia 51. évfolyam 1. szám

8 tás (24, 28). Jelen vizsgálatunkban bemutattuk, hogy a sugárkezelés nagy hatással van a tumorerekre. A rhuepoα-kezelt állatokban az élô tumormasszában az erek kitágulnak, a kontrollhoz képest az átlagos érátmérô szignifikánsan megnô. Ezek az EPO-aktivált erek abnormális alakot vesznek föl, az endotheliális sejtek több rétegben helyezkednek el, míg a pericita-borítás diszkontinuussá válik. Kimutattuk, hogy a rhuepoα-módosított erek nagyobb hatásfokkal roncsolódtak a besugárzás révén. Ez az eredmény alátámasztja mások munkáját, miszerint az exogén rhuepo-k fokozzák az endotheliális sejtek sugárérzékenységét, növelve apoptózisukat (10, 30). Mások kimutatták, hogy a VEGF-receptor tirozinkinázaktivitásának gátlása fokozza a besugarazott erek érzékenységét, mikor az erek perfúziója és a tumor oxigenizáltsága megnövekedik (15, 44, 46). Másrészt, jól ismert, hogy a VEGF-expresszió a HIF szabályozása alatt áll (6). Korábban bemutattuk, hogy mind a gazdaszervezet, mind a tumor VEGF-expressziója szignifikánsan csökkent a rhuepoα-kezelt xenograftokban a kontrollhoz képest (41). Jelenlegi eredményeink azt jelzik, hogy a HIF-1α felelôs lehet a csökkent VEGF-expresszióért, miután a HIF-1α génexpressziója szintén csökkent sugárterápia elôtt a rhuepo-kezelt állatokban. Néhány adat arra utal, hogy szoros korreláció van a HIF-1α-expresszió és a tumorprogresszió között (16), és a HIF-1-regulált citokinek fokozzák az endothelsejtek sugárrezisztenciáját is (28). A besugarazást követô HIF-1-aktiváció gátlásával továbbá szignifikánsan nôtt a tumorok sugárérzékenysége az érpusztulás révén (28). Korábbi, illetve jelen munkánkban bemutattuk, hogy a rhuepoα, mint erôs angiogenikus faktor, szignifikánsan tágultabb ereket eredményezett az élô tumortömegen belül az endothelsejtek proliferációjának növelésével. Ugyanakkor a HIF-1α expressziója csökkent, amely csökkent VEGF-expressziót okozott, és ez az endothelsejtek fokozott sugárézékenységét eredményezte. Ezek a besugárzás elôtti változások a tumor regressziójához vezettek a sugárkezeléssel kombinált terápiában. Az eredmények arra utalnak, hogy a rhuepoα-kezelés legalább kétféle hatással van a tumorokra: az egyik, hogy képes csökkenteni a hypoxiát, amely önmagában is kedvezôtlen jele a prognózisnak; a másik, hogy növeli az endotheliális sejtek proliferációját, ezzel javítja az erek sugárérzékenységét és a tumorszövet oxigénnel, illetve kemoterápiás szerekkel történô perfúzióját. Preklinikai adataink megerôsítik korábbi eredményeinket, miszerint a rhuepoα hatása a tumorstromára módosítja a daganatok terápiás érzékenységét. A rhuepoα-kezelés egyéb kiegészítô eljárásokkal (anti-angiogenezis, hypoxia-indukált génterápia (34), anti-hif-1α) kiegészítve hasznos lehet a hagyományos kemo- és/vagy sugárterápia hatékonyságának fokozására. Természetesen e kérdések megválaszolásához további preklinikai és klinikai vizsgálatok szükségesek. Köszönetnyilvánítás Köszönetet mondunk Parragné Derecskei Katalinnak és Sinka Andrásnénak a kísérletek kivitelezésében nyújtott technikai segítségükért, valamint Dr. Ladányi Andreának a kézirat kritikus áttanulmányozásáért. Irodalom 1. Acs G, Acs P, Beckwith SM, et al. Erythropoietin and erythropoietin receptor expression in human cancer. Cancer Res 61: , Anagnostou A, Lee ES, Kessimian N, et al. Erythropoietin has a mitogenic and positive chemotactic effect on endothelial cells. Proc Natl Acad Sci USA 87: , Arcasoy MO, Jiang X, Haroon ZA. Expression of erythropoietin receptor splice variants in human cancer. Biochem Biophys Res Commun 307: , Batra S, Perelman N, Luck LR, et al. Pediatric tumor cells express erythropoietin and a functional erythropoietin receptor that promotes angiogenesis and tumor cell survival. Lab Invest 83: , Blackwell KL, Kirkpatrik JP, Snyder SA, et al. Human recombinant erythropoietin significantly improves tumor oxygenation independent of its effects on hemoglobin. Cancer Res 63: , Blohmer JU, Wurschmidt U, Petry G. 6th interim analysis of a prospective, randomized, open and controlled AGO- and NOGGO-intergroup study: Sequential adjuvant chemo-radiotherapy with vs. without epoetin alfa for patients with high risk cervical cancer. Proc Am Soc Clin Oncol 22:447, Bohlius J, Wilson J, Seidenfeld J, et al. Recombinant human erythropoietins and cancer patients: updated meta-analysis of 57 studies including 9353 patients. J Natl Cancer Inst 98: , Caro JJ, Salas M, Ward A, Goss G. Anemia as an independent prognostic factor for survival in patients with cancer. Cancer 91: , Forsythe JA, Jiang BH, Iyer NV, et al. Activation of vascular endothelial growth factor gene transcription by hypoxia inducible factor 1. Mol Cell Biol 23: , Garcia-Baross M, Paris F, Cordon-Cardo C, et al. Tumor response to radiotherapy regulated by endothelial cell apoptosis. Science 300: , Gorski DH, Beckett MA, Jaskowiak NT, et al. Blockage of the vascular endothelial growth factor stress response increases the antitumor effects of ionizing radiation. Cancer Res 59: , Hall EH. Ed. Radiobiology for the Radiologist, 4th ed. Philadelphia, PA, Lippincott, Harris AL. Hypoxia a key regulatory factor in tumour growth. Nat Rev Cancer 2:38-47, Henke M, Laszing R, Rube C, et al. Erythropoietin to treat head and neck cancer patients with anaemia undergoing radiotherapy: randomized, double-blind, placebo-controlled trial. Lancet 36: , Huber PE, Bischof M, Jenne J, et al. Trimodal cancer treatment: beneficial effects of combined antiangiogenesis, radiation and chemotherapy. Cancer Res 65: , Ishikawa H, Sakurai H, Hasegawa M, et al. Expression of hypoxia-inducible factor 1alpha predicts metastasis-free survival after radiation therapy alone in stage IIIB cervical squamous cell carcinoma. Int J Radiat Oncol Biol Phys 60: , Jaquet K, Krause K, Tawakol-Khodai M, et al. Erythropoietin and VEGF exhibit equal angiogenic potential. Microvasc Res 64: , Kirkpatrick JP, Hardee ME, Snyder SA, et al. The effect of darbepoetin alfa on growth, oxygenation and radioresponsiveness of a breast adenocarcinoma. Radiat Res 165: , LaMontagne KR, Butler J, Marshall DJ, et al. Recombinant epoetins do not stimulate tumor growth in erythro- 60 Magyar Onkológia 51. évfolyam 1. szám 2007 MagyAR ONKOLÓGUSOK Társasága

9 poietin receptor-positive breast carcinoma models. Mol Cancer Ther 5: , Laveys RS. Clinical trial experience using erythropoietin during radiation therapy. Strahlenther Onkol 174(Suppl 4):24-30, Leyland-Jones B. Breast cancer trial with erythropoietin terminated unexpectedly. Lancet Oncol 4: , Littlewood TJ, Nortier J, Rapoport B, et al. Epoetin alfa corrects anemia and improves quality of life in patients with hematologic malignancies receiving non-platinum chemotherapy. Hematol Oncol 21: , Littlewood TJ. The impact of hemoglobin levels on treatment outcomes in patients with cancer. Semin Oncol 28:49-53, Lövey J, Lukits J, Remenár E, et al. Antiangiogenic effects of radiotherapy but not initial microvessel density predict survival in inoperable oropharyngeal squamous cell carcinoma. Strahlenther Onkol 182: , Ludwig H. rhuepo and treatment outcomes: the preclinical experience. Oncologist 9:48-54, Marinaccio M, Mele E, Giotta F. Pretreatment normalization of mild anemia with epoetin alfa: impact on the outcome in epithelial ovarian cancer patients. Proc Am Soc Clin Oncol 22:486, Mittelman M, Neumann D, Peled A, et al. Erythropoietin induces tumor regression and antitumor immune responses in murine myeloma models. Proc Natl Acad Sci USA 98: , Moeller BJ, Cao Y, Li CY, Dewhirst MW. Radiation activates HIF-1 to regulate vascular radiosensitivity in tumors: role of reoxygenation, free radicals, and stress granules. Cancer Cell 5: , Molls M, Stadler P, Becker A, et al. Relevance of oxygen in radiation oncology. Mechanism of action, correlation to low hemoglobin levels. Strahlenther Onkol 74(Suppl 4):13-16, Paris F, Fuks Z, Kang A, et al. Endothelial apoptosis as the primary lesion initiating intestinal radiation damage in mice. Science 293: , Rades D, Tribius S, Yekebas EF, et al. Epoetin alfa improves survival after chemoradiation for stage III esophageal cancer: final results of a prospective observational study. Int J Radiat Oncol Biol Phys 65: , Reichel O, Panzer M, Wimmer Ch, et al. Prognostic implications of hemoglobin levels before and after surgery as well as before and after radiotherapy for head and neck tumors. Eur Arch Otorhinolaryngol 260: , Ribatti D, Marzullo A, Nico B, et al. Human erythropoietin induces a pro-angiogenic phenotype in cultured endothelial cells and stimulates neovascularization in vivo. Blood 93: , Scott SD, Greco O. Radiation and hypoxia inducible gene therapy system. Cancer Metastasis Rev 23: , Spivak JL. Recombinant human erythropoietin and the anemia of cancer. Blood 84: , Stasi R, Amadori S, Littlewood TJ, et al. Management of cancer-related anemia with erythropoietic agents: doubts, certainties, and concerns. Oncologist 10: , Stüben G, Pöttgen C, Knuhmann K, et al. Erythropoietin restores the anaemia-induced reduction in radiosensitivity of experimental human tumors in nude mice. Int J Radiat Oncol Biol Phys 55: , Tchekmedyian NS. Anaemia in cancer patients: significance, epidemiology, and current therapy. Oncology 1:17-24, Temkin SM, Hellmann M, Serur E, et al. Erythropoietin administration during primary treatment for locally advanced cervical carcinoma is associated with poor response to radiation. Int J Gynecol Cancer 16: , Thews O, Kelleher DK, Vaupel P. Erythropoietin restores the anemia-induced reduction in cyclophosphamide cytotoxicity in rat tumors. Cancer Res 61: , Tóvári J, Gilly R, Rásó E, et al. Recombinant human erythropoietin alpha targets intratumoral blood vessels improving chemotherapy in human xenograft models. Cancer Res 65: , Vaupel P, Kelleher DK, Höckel M. Oxygenation status of malignant tumors: pathogenesis of hypoxia and significance for tumor therapy. Semin Oncol 28:29-35, Vaupel P, Thews O, Hoeckel M. Treatment resistance of solid tumors. Med Oncol 18: , Winkler F, Kozin SV, Tong RT, et al. Kinetics of vascular normalization by VEGFR2 blockade governs brain tumor response to radiation: role of oxygenation, angiopoietin-1, and matrix metalloproteinases. Cancer Cell 6: , Yasuda Y, Musha T, Tanaka H, et al. Inhibition of erythropoietin signaling destroys xenografts of ovarian and uterine cancers in nude mice. Br J Cancer 84: , Zips D, Eichler W, Geyer P, et al. Enhanced susceptibility of irradiated tumor vessels to vascular endothelial growth factor receptor tyrosine kinase inhibition. Cancer Res 65: , 2005 ERYTHROPOIETIN-α HATÁSA A SUGÁRKEZELÉSRE Magyar Onkológia 51. évfolyam 1. szám