Kozma Péter - Interferometrikus optikai hullámvezetőbioszenzor jelölésmentes érzékeléshez

Méret: px
Mutatás kezdődik a ... oldaltól:

Download "Kozma Péter - Interferometrikus optikai hullámvezetőbioszenzor jelölésmentes érzékeléshez"

Átírás

1 1

2 Kozma Péter Interferometrikus optikai hullámvezetőbioszenzor jelölésmentes érzékeléshez - Doktori (PhD) értekezés - Pannon Egyetem Molekuláris- és Nanotechnológiák Doktori Iskola 1 valamint Magyar Tudományos Akadémia Műszaki Fizikai és Anyagtudományi Kutatóintézete 2 Témavezetők: Dr. Horváth Róbert 2 és Dr. Petrik Péter 2 Budapest,

3 Interferometrikus optikai hullámvezetőbioszenzor jelölésmentes érzékeléshez - Értekezés doktori (PhD) fokozat elnyerése érdekében - Írta: Kozma Péter Készült a Pannon Egyetem Molekuláris- és Nanotechnológiák Doktori Iskolájában Témavezetők: Dr. Horváth Róbert és Dr. Petrik Péter Az értekezést témavezetőként elfogadásra javaslom: Dr. Horváth Róbert: igen / nem.. (aláírás) Dr. Petrik Péter: igen / nem.. (aláírás) A jelölt a doktori szigorlaton %-ot ért el. Az értekezést bírálóként elfogadásra javaslom: Bíráló neve:. igen / nem Bíráló neve:. igen / nem.. (aláírás) (aláírás) A jelölt az értekezés nyilvános vitáján %-ot ért el. A Bíráló Bizottság elnöke A doktori (PhD) oklevél minősítése Veszprém,.. Az EDT elnöke 3

4 Előszó Az Interferometrikus optikai hullámvezetőbioszenzor jelölésmentes érzékeléshez című doktori értekezés alapjául szolgáló kutatásokat, mint a Pannon Egyetem Molekuláris- és Nanotechnológiák Doktori Iskolájának állami ösztöndíjas diákja a Magyar Tudományos Akadémia Műszaki Fizikai és Anyagtudományi Kutatóintézetének Nanotechnológia, Optika és Fotonika laboratóriumaiban végeztem. Hálásan köszönöm mindkét intézet, s a Magyar Állam támogatását, mely nélkül e munka nem születhetett volna meg. A fent megnevezett intézményekben fejlesztés alatt áll a flagelláris filamentum felismerő elemeket alkalmazó, kisméretű, jelölésmentes optikai hullámvezető bioszenzor, az ún. rácscsatolt interferométer jelátalakító. Ezzel az eszközzel reményeink szerint pár év múlva költséghatékony módon, akár laboratóriumi körülményeken kívül is, kiemelkedő érzékenységgel, specifikusan detektálhatunk majd különféle célmolekulákat. Doktori munkám során ezen interdiszciplináris kutatás módszer- és műszerfejlesztéssel kapcsolatos, eddig felmerült kérdéseire próbáltam egy-egy megoldást találni. Eredményeimet e disszertációban foglalom össze. Mivel a fenti kutatás több párhuzamos fejlesztési eredmény együtteséből áll majd össze egyetlen egésszé, melyekkel több intézmény kutatóinak egyidőben kell előrehaladniuk a világos mondanivaló háttérbe szorítása nélkül e disszertáció sem tárgyalhatja e párhuzamos szálakat egyetlen egységként. Következésképp a dolgozat felépítése is kénytelen kissé eltérni a hagyományos tárgyalásmódtól. Az olvasó tehát joggal érezheti úgy, hogy rendre váltják egymást a bevezetéshez, az anyagok és módszerek, eredmények és az eredmények megvitatása alfejezetekhez illőrészek. Ám, ha úgy fogja kezébe e munkát, hogy az érdemi, 6- os, 7-8-as és 9-es fejezeteket, mint önálló egységeket olvassa, a megszokott didaktikai rend megváltozása miatt szerkezetében kevésbé hagyománytisztelőnek tűnő dolgozat talán könnyebben megmutatja a maga sajátos rendszerét. 4

5 Tartalomjegyzék Előszó 4 Tartalomjegyzék 5 1. Bevezetés 7 2. A doktori munkát motiváló tényezők 9 3. A dolgozat rövid kivonata három nyelven Kivonat Abstract Zusammenfassung A disszertációban használatos fontosabb jelölések Bioérzékelés alapjai Jelölésmentes bioérzékelők felismerőelemei Receptorok Enzimek Antitestek Nukleinsavak Flagelláris filamentumok Jelölésmentes érzékelők jelátalakítói Tömegérzékeny jelátalakítók Hőmennyiségmérőjelátalakítók Elektrokémiai jelátalakítók Optikai jelátalakítók Flagelláris filamentum alapú érzékelőrétegek minősítése Ex situ felületanalízis Mintakészítés Modellalkotás és spektrum kiértékelés In situ felületanalízis Előkészületek az in situ kísérletekhez In situ kísérletek A fehérjeréteg szerkezetanalízise egy lehetséges megoldás Összefoglalás és kitekintés 53 5

6 7. Rácscsatolt interferométer - refraktometria Az elsőmérési összeállítás Integrált optikai egység Folyadékkristály modulátor A szenzorműködés elve A mérés menete Az első, működést igazoló kísérletek Összegzés Rácscsatolt interferométer bioszenzorikai kísérletekhez A válaszjel kiértékelés új formája A valós idejűvezérlőés kiértékelőalgoritmus A zaj hatásának csökkentése referencia alkalmazásával Nagy felbontású kísérletek rácscsatolt interferométerrel Refraktometria és fehérje adszorpció vizsgálat Felismerőelem - célmolekula típusú érzékelés Összegezés és kitekintés Rácscsatolt interferométer - spektroszkópiai ellipszométer kombinált összeállítás A mérési összeállítás Az elsőmérési eredmény Összegzés és kitekintés Összefoglalás Tézispontok Conclusions Köszönetnyilvánítás Függelék - Fényterjedés közegben és közeghatáron Síkhullámok homogén közegben Interferencia Síkhullámok közegek határán Az ellipszometria Az ellipszometriai modellek alapjai Fontosabb ellipszometriai rétegmodellek Hullámvezetés izotróp közegben Nematikus folyadékkristály modulátor Irodalomjegyzék 123 6

7 1. Bevezetés A nanotechnológia területén az évtized egyik főkutatási iránya olyan érzékelők, érzékelőrendszerek megalkotása és fejlesztése, melyek képesek mind nagyobb és nagyobb érzékenységgel, gyors és költséghatékony módon detektálni akár kisebb molekulák, sőt akár önálló atomok valamilyen felismerőelemhez történőkötődését is. Az ilyen irányú törekvések eredményeit főként a gyógyszerkutatásban hasznosítják, ahol fontos szerepet töltenek be a molekuláris kölcsönhatások kutatásában, mint például a gyógyszer, toxicitás és hatékonyság vizsgálatok [1, 2], új orvos-diagnosztikai és terápiás eljárások fejlesztése [3, 4] területén. Az orvosi, biológiai kutatásokon túl az igazságügy (drog, dopping vizsgálatok, stb.) és az ipar (víz- és ételminőség ellenőrzés, stb.) is széles körben alkalmaz ilyen eszközöket [5, 6]. Ezek a vizsgálatok jellemzően rendkívül parányi, 500 Da-nál kisebb molekulatömeggel rendelkező, ~ pg/ml (esetenként ~ fg/ml) koncentrációban jelen lévőcélmolekulák érzékeny és specifikus kimutatását kívánják olyan oldatokban, ahol egy időben és nagy mennyiségben más molekulák is megtalálhatók [7]. Napjainkban a felismerőelem - célmolekula típusú kísérleteket többnyire úgy végezik, hogy a vizsgálandó molekulákat radioaktív, fluoreszcens vagy mágnesezhetőanyagokkal megjelölik, majd a megfelelőeljárással a jelölők által szolgáltatott jelet keresik a vizsgált térfogatban vagy felületen [2, 8]. Az ilyen eljárásokkal érhetőel ma a legnagyobb érzékenység, hiszen a jelölőt követve akár egyetlen apró molekula bekötődése is megfigyelhető. E kétségtelen előnyük mellett azonban számos hátránnyal rendelkeznek. A detektálandó molekulák megjelölése nem csupán rendkívül idő-, laboratórium- és költségigényes, de maga a jelölés is kihatással lehet a vizsgált folyamat mérési eredményeire [1]. Ennek okán az ilyen irányú kutatások az elmúlt években mind inkább a jelölésmentes alkalmazások felé fordultak. A legígéretesebb jelölésmentes mérési eljárások, ún. jelátalakítók közé tartoznak az optikai hullámvezető alapú érzékelők, melyek kihasználva a fény határfelületről való teljes visszaverődés képességét, a terjedőmódus ún. evaneszcens mezejének segítségével vizsgálják a hullámvezető réteg felültén végbemenő folyamatokat [9, 10, 11]. Ilyen eszközök alkalmazásával oldatok törésmutatójának (kivitelezéstől függően) ötödik - hatodik - hetedik tizedesjegyében történőváltozása detektálható, illetve az érzékelő felületre leválasztott fehérjerétegek vastagsága akár nanométer alatti pontossággal meghatározható [7, 12, 13, 14, 15, 16]. Indokolt tehát a felismerőelemeket hullámvezetőstruktúrákra, chipekre rögzíteni. Ekkor lehetőség nyílik arra, hogy az általuk megkötött célmolekulák nem csupán kvalitatív, 7

8 hanem kvantitatív analízise is megvalósítható legyen. A szenzorchipet folyadékcellával felszerelt mérőkészülékbe helyezve in situ (latin, folyamat közben) és valós időben mérhetjük a célmolekulák kötődését [10, 11, 12, 17]. További előnye a látható tartománybeli optikai módszerek alkalmazásának, hogy az ilyen típusú folyamatokat nagy érzékenységgel követhetjük anélkül, hogy a vizsgált rendszer bármiféle károsodást szenvedne, illetve, hogy jelentékeny módon beavatkoznánk a kísérlet menetébe. 8

9 2. A doktori munkát motiváló tényezők Számos, különféle elven alapuló bioérzékelővált mára hatékony és új eredményekre mutató mérési eljárássá, azonban egyedi hibáikon kívül, főés közös hátrányuk a magas piaci áruk. A jövőbioérzékelőinek azonban költséghatékony módon kell biztosítaniuk a lehetőséget arra, hogy akár analitikai laboratóriumokon kívül is, gyors és megbízható méréseket végezhessünk. A felismerő elemek és jelátalakítók fejlesztői számára a jelen kihívása, hogy e célt megvalósítsák. A veszprémi Pannon Egyetemen (PE) folyó kutatások közül a legígéretesebbek közé tartoznak a Nanotechnológia tanszék, Prof. Vonderviszt Ferenc csoportjának azon kísérletei, melyek módosított baktérium ostorok, ún. flagelláris filamentumok felismerőelemekként történőalkalmazását célozzák. Bíztató eredményeik alapján várható, hogy hamarosan olyan in vivo (latin, az élőszervezetben) sokszorosítható, mutáns filamentumokat hozzanak létre, melyekkel specifikus, jó hatásfokú és olcsó detektálás valósítható meg. E kísérletekkel párhuzamosan, az egyetemmel munkakapcsolatban álló Műszaki Fizikai és Anyagtudományi Kutatóintézet (MFA) Fotonika osztályán végezett kutatások az ún. vad (módosítatlan, detektálásra még képtelen) flagelláris filamentumok felhasználásával a közeli jövőben megvalósításra kerülőfelismerőelemek megfelelőjelátalakítóba történőintegrálását készítik elő. Az ilyen irányú fejlesztések alapvetően két részre, módszer- és műszerfejlesztési egységekre bonthatók. Az előbbi esetében nem csupán a felismerőelemek érzékelőfelületére történőrögzítésének technikáját kell megoldani, hanem egy olyan mérési eljárást is ki kell fejleszteni, mellyel a felületre leválasztott fehérjeréteg minősége, opto-geometriai tulajdonságai meghatározhatók, illetve ellenőrizhetők. Egy ilyen eljárás kifejlesztése a minőségi bioérzékelők gyártásának egyik kulcsa. A sikeresen előállított flagelláris filamentum felismerőelemek kisebb molekulák, vagy akár atomok jelenlétét detektálják majd a kívánt oldatban. Az ilyen apró célmolekulák bekötődése csupán a legérzékenyebb mérési eljárásokkal követhetők nyomon. Az e célra legalkalmasabbnak ígérkezőhullámvezetőalapú módszerek közül, számos előnye miatt, az MFA és a PE közös nanoszenzorikai laboratóriumában fejlesztés alatt álló rácscsatolt interferométerre esett a választás, hogy az érzékelő felületére immobilizált flagelláris filamentum felismerőelemekkel korszerű, költséghatékony és nagy érzékenységűdetektálást valósítson majd meg. 9

10 3. A dolgozat rövid kivonata három nyelven 3.1. Kivonat Interferometrikus optikai hullámvezetőbioszenzor jelölésmentes érzékeléshez Doktori munkám elsőrészében javaslatot teszek egy gyors, érzékeny, roncsolásmentes és költséghatékony optikai eljárás, a spektroszkópiai ellipszometria alkalmazására, mellyel az összetett rétegszerkezetű hordozókra leválasztott flagelláris filamentum rétegek optogeometriai paraméterei meghatározhatók. Folyadékcellás kísérletekkel bemutatom, hogy a mérési módszer jól használható e fehérjék felületre történőleválasztásának in situ és valós idejű nyomon követésére, sőt minősítésére is. Megmutatom, hogy spektroszkópiai ellipszométerrel a fehérjeréteg tömegsűrűségének mélységbeli eloszlása is meghatározható, melynek alapján a filamentumokból felépülőréteg háromdimenziós struktúrája kutatható. Doktori munkám második részében, egy olyan jelölésmentes, optikai érzékelő, ún. rácscsatolt interferométer (ang. Grating Coupled Interferometer GCI) jelátalakító prototípus megépítéséről és fejlesztéséről számolok be, mely egyszerű és olcsó optikai elemeket alkalmazva minden tekintetben felveszi a versenyt napjaink csúcskészülékeivel. Egyszerre érvényesíti az interferometria-alapú hullámvezetőmódszerek által biztosított tág mérési tartományokon belüli rendkívüli érzékenységet [18, 19, 20, 21, 22] a rácscsatolók egyszerűségével [9]. Mivel mozgó alkatrészeket nem tartalmaz, potenciális lehetőséget biztosít kézi-műszer gyártásra, továbbá más eljárásokkal való összeházasításra. Amennyiben a készülék érzékelő felületét felismerő elemekkel látjuk el, kitűnően alkalmazható akár bioszenzorikai kutatásokra is Abstract Optical Waveguide Interferometer for label-free Biosensing In the first part of the present thesis, a fast, sensitive, non-destructive and cost-effective optical method, the spectroscopic ellipsometry (SE) is proposed for the characterization of the opto-geometrical parameters of the flagellar filament protein layers deposited on complex multilayer substrates. By introducing a flow-cell, SE can be successfully applied for in situ and real quantitative monitoring of the protein deposition from aqueous solutions. It is also demonstrated that SE is able to reveal the in-depth mass density profile of the protein layers. Based on the obtained in-depth information, the three-dimensional structure of the filamentous layer can be investigated. 10

11 The second part of the thesis deals with the development of the Grating Coupled Interferometer (GCI) label-free optical sensor prototype, built of simple and low-cost components. Combining the wide measurement range and the excellent sensitivity of the interferometry based waveguide methods [18, 19, 20, 21, 22] with the simplicity of grating couplers [9] the device has become a competitor of today's top biosensor devices. Since this instrument does not contain any moving parts, it is a promising candidate for being used in handheld sensing devices. Moreover, it has a great potential in easy combination with other methods. Functionalizing the sensor surface of GCI with appropriate recognition elements the device can be excellently applied in biosensoric research, as well Zusammenfassung Interferometrischer Biosensor basierend auf optischem Wellenleiter zur Detektion ohne Marker Im ersten Teil der vorliegenden Doktorarbeit wird ein schnelles, sensitives, zerstörungsfreies und kostenwirksames Verfahren, die Spektroskopische Ellipsometrie vorgeschlagen, mit deren Hilfe die optischen und geometrischen Parameter der Flagellin-Faserproteinen, die auf ein Substrat mit komplexer Schichtstruktur abgeschieden werden, bestimmt werden können. Anhand von Experimenten mit einer Durchflusszelle wird gezeigt, dass diese Methode gut geeignet ist, um in situ und echtzeitig die Proteinablagerung auf der Oberfläche zu verfolgen und zu bewerten. Außerdem wird gezeigt, dass mit dem Spektoskopischen Ellipsometer das Tiefenprofil der Proteinenschichten gemessen werden kann, anhand dessen die dreidimensionale Oberflächenstruktur der Faserschichten erforscht werden kann. Im zweiten Teil der Arbeit wird zur markierungsfreien optischen Detektion die Entwicklung eines Prototyps eines so genannten Gitterkoppler-Interferometers (eng. Grating Coupled Interferometer - GCI) gezeigt, welcher aus einfachen und günstigen optischen Elementen aufgebaut ist. Dank der Kombination eines grossen Messbereichs und der hervorragenden Empfindlichkeit der Interferometrie-basierten Wellenleitermethoden [18, 19, 20, 21, 22] mit der Einfachheit der Gitterkoppler [9] vermag GCI in jeder Hinsicht im Wettbewerb heutiger Spitzengeräte mitzuhalten. Da er keine beweglichen Teile enthält, ist das Prinzip hervorragend für die Herstellung tragbarer Geräte oder die Integration in andere Messverfahren geeignet. Durch die Funktionalisierung der Oberfläche mit spezifischen Erkennungsmolekülen findet der Sensor eine Anwendung in den biophysikalischen Forschungen. 11

12 4. A disszertációban használatos fontosabb jelölések t időkoordináta τ időállandó r(x,y,z) helyvektor E(r,t) elektromos térerősség B(r,t) mágneses indukció D(r,t) elektromos eltolás H(r,t) mágneses térerősség n törésmutató n o ordinárius törésmutató n e extraordinárius törésmutató N effektív törésmutató ε permittivitás μ permeabilitás k hullámszám λ hullámhossz ω körfrekvencia c fénysebesség φ, Φ fázis ΔΦ(t,t 0 ) relatív fázistolás A amplitúdó I intenzitás d vastagság (r,t) elfordulás szöge α orientációs szög, Ψ ellipszometriai szögek κ rugalmassági együttható γ forgási viszkozitás m módus száma Γ tömegsűrűség l, L hosszúság σ szórás S érzékenység FF GA APTES PBS SE GCI OWLS DPI SPR AFM SEM flagelláris filamentum glutáraldehid 3-aminopropil-trietoxi-szilán foszfát puffer spektroszkópiai ellipszométer rácscsatolt interferométer optikai hullámvezető fénymódus spektroszkóp dupla polarizációs interferométer felületi plazmon rezonancia spektroszkóp atomerőmikroszkóp pásztázó elektronmikroszkóp 12

13 5. Bioérzékelés alapjai 1967-ben Updike és Hicks megalkotta az elsőbioérzékelőt [23]. Azóta már számos hasonló eszköz látott napvilágot [4], fejlesztésük azonban mind egyre nagyobb erőkkel zajlik. Méretük és áruk csökkentése, valamint érzékenységük, stabilitásuk és specifikusságuk növelése újabb és újabb kihívásokat jelentenek a kutatók és az ipar számára. Parányi, olcsó és megbízható eszközök piaci érvényesítése a fejlesztők vágyálma, melyeknek az élet legkülönfélébb területein történő alkalmazása megkönnyítik komfortérzetünket. Gondoljunk csak a vércukorszint ellenőrzőkészülékekre, melyek a cukorbetegek biztonságos inzulinadagolását segítik [4]. A bioérzékelő egyik lehetséges meghatározását Turner adta, aki a következőképpen fogalmazott: A bioérzékelőkompakt analitikai eszköz vagy egység, melyben biológiai vagy biológiai útón előállított érzékeny felismerőelemet integrálnak fizikai-kémiai jelátalakítóba. [24] Turner definícióját a ábra szemlélteti, bővebb kifejtése a következőalfejezetekben olvasható ábra: A bioérzékelők összefoglaló jellegű vázlata: a vizsgálandó célmolekulát a felismerőelem érzékeli, majd e hatást a jelátalakító erősített jellé formálja [4] Jelölésmentes bioérzékelők felismerőelemei A molekuláris felismerés az egyik lényegi kutatási iránya a biológiai érzékelés fejlődésének. A felismerőelemeket többnyire még élőszervezetekből nyerik ki, azonban napjainkra már gyakori a laboratóriumi úton előállított ún. szintetikus elemek használata is. Alkalmazva a modern biotechnológia nyújtotta lehetőségeket, ma már tetszőleges DNS szekvenciákat is szintetizálhatunk, megnyitva ezzel a kaput olyan felismerőelemek megalkotása és így olyan célmolekulák detektálása felé, melyekre nincs példa a természetben. 13

14 A következőáttekintés csupán a legfontosabb és legígéretesebb természetes és mesterséges felismerőelemek (receptorok, antitestek, enzimek, nukleinsavak és flagelláris filametumok) rövid bemutatására szorítkozik, a pontos részletekre nem tér ki. Ezek részletgazdag kiegészítése a szövegben megjelölt referenciákban található Receptorok A receptorok (latin, felfogó szerv) ígéretes felismerőelemek, hiszen a természetben betöltött szerepük is részben a specifikus azonosítás. Különféle méreganyagok és hatóanyagok természetes célpontjai évmilliárdok óta. Mint közvetítő transzmembrán fehérjék a célmolekula megkötését valamilyen biológiai jelátvitel segítségével továbbítják a gazdasejtjüknek a sejt felületéről a sejtmembránon át a sejt megfelelőrészébe. A ligandum bekötődése a receptor konformációváltozását eredményezi, mely további csatolt eseménylánc következményeként kiváltja a megfelelő sejtválaszt (pl.: sejtmembrán csatornák nyitása/zárása, sejtműködés-változás) [25, 26]. A receptor preparátumok nagy lingandum specificitásuk és affinitásuk miatt vonzó felismerő elemek, hátrányuk azonban, hogy kevésbé stabilak, valamint labor- és költségigényes tisztítási folyamatokkal izolálhatók csupán a sejtmembránból. Rekombináns technikák alkalmazásával e hátrány enyhíthető. Mivel az ilyen receptor - ligandum jellegűfelismerés esetén semmilyen jelerősítő hatásról nem beszélhetünk csak a legérzékenyebb jelátalakítók segítségével detektálhatók az ilyen események [27] Enzimek Az enzimek szintén gyakran használt felismerőelemek a bioszenzorikai kutatásokban. Esetükben is, hasonlóan a receptorokhoz, a természetbeni szerepüket használják ki a célmolekulák érzékelésére. Az enzimfehérjék ún. aktív centrumain katalizált, az enzimekre jellemzőkémiai folyamatokhoz szükséges vegyületek, ún. szubsztrát-ok specifikus megkötése és ezek reakciótermékekké, ún. produktum-okká alakítása adja az érzékelés alapját. A keletkező produktumok számát mérve ugyanis választ kaphatunk a detektálni kívánt célmolekulák (esetünkben a szubsztrátok) jelenlétére és azok mennyiségére. Az alloszterikus enzimek egy vagy több olyan szabályzó szerkezeti egységgel rendelkeznek, melyekre az ún. effektor-ok bekötődésükkel hatnak. A bekötődés szerkezeti változásokra kényszeríti az enzimfehérjét, mely következtében alkalmassá, illetve alkalmatlanná válik az általa katalizált folyamat elvégzésére. Az ilyen hatásokat rendre alloszterikus aktivitásnak, 14

15 illetve alloszterikus gátlásnak nevezzük. Amennyiben a detektálandó célmolekula az effektor, az alloszterikus kötőhely és az aktív centrum együtt jelátalakítóval és jelerősítővel ellátott bioérzékelőt alkotnak. A mérendőjel az előállított produktum mennyisége [28]. Az ilyen enzim felismerőelemek hátránya, hogy bonyolult, több doménes, több alkotóelemes szerkezetük miatt nehezebben előállíthatóak. Továbbá, hogy a szubsztrát folytonos produktummá történőkatalízise csökkenti a szubsztrát koncentrációt, mely hatással van a katalízis sebességére, ez pedig megzavarja a valós idejűméréseket. Még annak ellenére is, hogy a világpiacot uraló glükóz szenzor enzim katalízis elven működik, ideálisnak mégsem az ilyen jellegűdetektálást tekintjük [4] Antitestek Az enzim alapú glükóz szenzor kivételével a gyors mérőrendszerek napjainkban főként antitesteket használnak felismerőelemekként a célmolekulák azonosítására és mennyiségi analízisére. Az antitestek népszerűsége 1984-től eredeztethető, mikor Kohler és Milstein javasolt egy később Nobel-díjjal jutalmazott eljárást, mely segítségével már monoklonáris antitestek is nagy mennyiségben izolálhatóak. Az antitest felismerőelemeket tartalmazó bioérzékelők a rendkívül érzékeny és specifikus a biomolekuláris antitest - antigén kölcsönhatásra építenek. Mára már könnyebben előállítható, olcsóbb rekombináns antitestek is elérhetőek, melyek genetikailag, a célmolekulának megfelelően módosított antigén kötőhellyel rendelkeznek [29]. Jelerősítés például ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) és IPCR (immuno-polymerase chain reaction) technikákkal valósítható meg [30] Nukleinsavak Tetszőleges szekvenciájú RNS (ribonukleinsav), illetve egyszálú DNS (dezoxiribonukleinsav) láncokat is használhatunk komplementereik hibridizációval történő detektálására. Ilyen felismerőelemeket alkalmaznak például a világon mára már széles körben elterjedt PCR és IPCR vizsgálatok. Továbbá a jövőben valószínűleg fontos szerepet játszanak majd a gyors, megbízható és költséghatékony DNS szekvenálás, illetve diagnosztika területén is [2, 8, 30, 31]. Kémiailag rendkívül stabilak, a nukleázoknak azonban csak módosított fehérje vázzal rendelkezőnukleinsav (ang. peptid nukleid acid - PNA) változataik állnak ellen [32]. A jövőtalán legígéretesebb felismerőelemei a néhány tíz bázishosszúságú ún. aptamer oligonukleotidok, melyek tipikusan elemszámú RNS, módosított RNS, egyszálú DNS, illetve módosított egyszálú DNS könyvtárakból irányított evolúció elvű SELEX 15

16 (systematic evolution of ligands by exponential enrichment) eljárással izolálhatóak és szaporíthatóak in vitro [33]. E mesterségesen előállított RNS vagy egyszálú DNS származékok két végén található állandó szekvencia közötti szakasz módosítható mindaddig, míg a kapott aptamer nagy affinitással és specificitással nem köt a kívánt célmolekulához. A felismerés hatékonyságát a célmolekulák színes palettáján a variációk hatalmas száma biztosítja. Nem komplementer nukleinsav típusú detektálás esetén is képes a ligandumot specifikusan megkötni annak térszerkezeti sajátosságai alapján [4]. Alkalmas jelöltjei analitikai és diagnosztikai alkalmazásoknak [34]. Számos előnyük közül néhány, hogy minimális méretűek, így könnyen reprodukálhatók és költséghatékony módon állíthatók elő, valamint végeik állandó szekvenciáinak révén könnyen immobilizálhatók. A célmolekula kötődés hatására jelentős mértékűkonformáció-változáson mennek keresztül, mely nem csupán megkönnyíti, de új lehetőségeket is nyit a jelátalakításra [35] Flagelláris filamentumok A baktériumok mozgásszervei a flagellumok, melyek sejten kívüli részei az 5-20 mikrométer hosszúságú, nanométer átmérőjű, fehérje alegységekből felépülő flagelláris filamentumok [36]. ( a. ábra) Minden egyes filamentumot egy-egy, a sejtmembránban található, 50 nanométer széles olyan forgómotor hajt ( b. ábra), mely fordulatszáma egyes fajoknál elérheti a hihetetlenül nagy, akár kilencvenezres percenkénti fordulatot is [37, 38]. A forgatáshoz szükséges energiát a sejtmembrán két oldala közötti protongradiens biztosítja, csak úgy, mint számos más biokémiai folyamat esetén. A flagelláris filamentumok a ábrán látható módon több tízezer flagellin fehérjéből a.) b.) ábra: a.) A baktérium sejtmembránjából kinyúló helikális propellerré szerveződött filamentumok b.) a filamentumot hajtó forgómotor sematikus rajza [36]. 16

17 felépülőtubuláris struktúrák. Ezek, a sejtmembránba ágyazott motorokhoz görbült szerkezetű, azonos fehérje alegységekből felépülő ún. kampók segítségével kapcsolódnak, melyek lehetővé teszik, hogy a filamentumok ne a motor tengelye által meghatározott, hanem a haladó mozgás szempontjából optimális forgástengely mentén foroghassanak [39]. E kampót a fehérjeszállal ún. HAP1 és HAP3 fehérjék rögzítik egymáshoz. A motor tengelyét felépítőötféle fehérjét, valamint a kampófehérjét, a flagellint és a HAP fehérjéket együttesen axiális fehérjéknek nevezzük. Ezek a citoplazmában szintetizálódnak, majd a filamentum tubuláris szerkezetéből adódó csatornán keresztül jutnak el beépülési helyükre, a filamentumok végére [39]. Itt az ún. HAP2 sapka szabályozza az érkező alegységek kapcsolódását, valamint ez védi a filamentumot az esetleges depolimerizációtól is. A Salmonella typhimurium törzsből preparált filamentumok és az ezeket felépítőflagellin alegységek szerkezetét röntgendiffrakciós és elektronmikroszkópos analízissel határozták meg. Kiderült, hogy a flagellinek négy lineárisan kapcsolódó doménből állnak, ezeket D0, ábra: A flagelláris filamentum felépítése: 1. Kampó 2. HAP1, HAP3 3. Flagellin alegységek 4. HAP2 sapka [36]. D1, D2, D3-mal jelölték. ( a. ábra) Továbbá, arra is fény derült, hogy körbejárva az ilyen filamentumokat 11 flagellin alegységet számolhatunk össze, melyek kölcsönhatva egymással koncentrikus szerkezetet alakítanak ki a szál hossztengelye körül [36, 38, 39] ( b. ábra). Az axiális irányban egymás felett elhelyezkedőalegységek N- és C- terminális régiói egymásba fonódó kötegeket képezve felépítik a c. ábrán piros színnel kihangsúlyozott, ún. protofilamentumot. Egy híján egy tucat ilyen protofilamentum együttese adja a filamentális (tubuláris) szerkezetet [40]. 17

18 a.) b.) c.) ábra: a.) A Salmonella typhimuriumból származó flagellinmolekulák atomi szerkezete. b.) Flagelláris filamentumokban e flagellin alegységek koncentrikus c) protofilamentális szerkezetbe rendező dnek, úgy hogy a D0 domének befelé, a D3 domének kifelé néznek [40]. A D3 domének a filamentum felszínén találhatók, így nem vesznek részt a szerkezet kialakításában. Éppen ezért, a D3 domén kiváló célpont génsebészeti beavatkozások számára, hiszen aminosavsorrendje szabadon módosítható anélkül, hogy a flagellin polimerizációs képessége sérülne, illetve a filamentális szerkezet módosulna. Ez a figyelemreméltó tulajdonság teszi különösen alkalmassá a flagellinmolekulákat arra, hogy belőlük meghatározott célmolekulák hatékony felismerésére és megkötésére képes mesterséges felismerőelemek legyenek előállíthatók [41]. Ennek tervezett menete a következő: A flagellin D3 doménjének felületén található három hurokrégiót kódoló génszakaszokat fehérjetervezés, célzott mutagenezis és irányított evolúciós eljárásokkal [42] módosítják, majd az így kapott mutáns géneket hordozó baktériumokat tenyésztik. Ezek filamentumait már a módosított felismerőflagellinek alkotják. E mutáns fehérjeszálakat a sejtekről való leválasztásuk után alkalmas mérőchip felületére rögzítik (ld.: fejezet). Mivel már egyetlen filamentumot is több tízezer felismerőflagellin alkot, és ilyen szálakból hatalmas mennyiséget köthetünk ki a jelátalakítók felületére, rendkívüli érzékenységgel bíró szenzorokat gyárthatunk majd. Megjegyzendő, hogy különbözőfelismerőrégiókkal rendelkező flagellineket kontrollált módon polimerizáltatva elvileg olyan flagelláris érzékelőszálakat és így olyan nanochipeket is létrehozhatunk, amelyek nem csupán egyetlen molekula, hanem akár egy vegyületcsalád felismerésére is képesek. 18

19 5. 2. Jelölésmentes érzékelők jelátalakítói A jelölésmentes bioszenzorokban az érzékelés alapját egy részről a célmolekula és a felismerő elem között létrejövőspecifikus reakció képezi. A felismerés valamilyen fizikai-kémiai változást hoz létre a rendszerben, mely azután egy alkalmas jelátalakító segítségével detektálandó és mérendő. Az előzőfejezetben bemutatott felismerőelemekhez fejlesztett jelátalakítók számos típusa lelhetőfel az irodalomban. Ezeket tömeg-, hőmennyiség-, elektrokémiai- vagy optikai változáson alapuló érzékeléstechnikák csoportjába sorolhatjuk [35, 43]. Terjedelem korlátok miatt, a következőalfejezetekben e csoportokra jellemző alapvető tulajdonságok tárgyalására szorítkozom, csupán a dolgozat szempontjából elengedhetetlenül fontos optikai módszereket részletezem. Az alfejezet végén található I. táblázat összegzi napjaink legfejlettebb és legígéretesebb jelátalakítóit megjelölve az egyes eszközökhöz tartozó maximális érzékenységet Tömegérzékeny jelátalakítók A tömegérzékeny jelátalakítók definíció szerint olyan fizikai mennyiséget mérnek, mely a felismerőelemek által megkötött célmolekulák össztömegének függvénye. Tipikusan egy rezgésbe hozott rendszer sajátfrekvenciájának elhangolódását követik optikai, piezorezisztív vagy kapacitív módszerekkel [44]. Bár ez a legfiatalabb méréstechnika e fejezetben tárgyaltak között, máris figyelemre méltó mérési érzékenységekről számol be az irodalom [45]. b.) a.) ábra: a.) A 0,3 mm vastag, 14 mm átmérő jűqcm piezoelektromos jelátalakító egység b.) saját frekvenciája a felületén megkötött célmolekulák össztömegének függvényében megváltozik [46]. 19

20 A kvarc-kristály mikromérleg (ang. quartz crystal microballance - QCM) eljárás alapvetően a piezoelektromos kvarc kristályoknak arra a tulajdonságára épül, hogy megfelelőfrekvenciájú váltófeszültséget kapcsolva rájuk rezonanciába hozhatók. E rezonanciafrekvencia értéke érzékeny függvénye a kvarckristály tömegének, így a felületére leváló tömeg elhangolja a rendszert [45]. Amennyiben a detektálni kívánt célmolekulának megfelelőfelismerőelemeket az érzékelők felületére csatolják, a felismerőelemek által megkötött célmolekulák száma tömegük ismeretében meghatározható ( ábra) [46]. A hasonló elven működőfelületi akusztikus hullámok (ang. surface acoustic waves - SAW) eljárás esetében egy membrán felületén terjedőmódus sebessége változik a felületére levált célmolekulák össztömegének függvényében [47]. Ide sorolhatók még a mikro- és nanomechanikus erőkarok (ang. micro- and nanomechanical cantilevers - MC) is, melyek a megkötött célmolekulák súlyával arányosan néhány nanométert meghajolnak ( a. ábra). A meghajlás mértéke optikai, piezorezisztív, kapacitív elven működőeljárásokkal olvasható ki [44]. Dinamikus módban mérve velük, a QCM-hez hasonlóan, a rezonanciafrekvenciájuk hangolódik el. Mivel a mikro- és nanomechanikus erőkarok könnyen tömbbe rendezhetők, nagyszámú párhuzamos mérés végezhetővelük ( b. ábra). E nagyszerűtulajdonság a jövőegyik legígéretesebb jelátalakító eljárásává teszi ezeket [2, 44]. a.) b.) ábra. a.) A tömbbe rendezett rugalmas erő karok a rájuk rögzített felismerőelemek által megkötött célmolekulák súlya alatt meghajolnak [8]. b.) Pásztázó elektronmikroszkóp felvétel egy kereskedelmi forgalomban már kapható 8 egységes mikromechanikus erő karról [48]. 20

21 Hőmennyiségmérőjelátalakítók A jelátalakítók hőmennyiség mérésén alapuló típusa azt az alapvetőtulajdonságát használja ki a kémiai reakcióknak, hogy az ilyen folyamatokat mindig hőváltozás (hőelnyelés vagy hőfejlődés) kíséri. Ennek oka, hogy a reakcióban résztvevőanyagok átalakulása során belső energiájuk megváltozik, majd környezetükkel újra termikus egyensúlyba kerülnek. Egy rendkívül érzékeny hőmennyiségmérővel általában termisztorral mérhetjük a felületére immobilizált felismerőelemek célmolekula megkötéskor fejlődőhőt. Egy kísérlet során mért összes hőmennyiség a felismerési reakcióban résztvevőcélmolekulák számával arányos. A jobb érzékenység érdekében érdemes energiaigényes folyamatokat követnünk, ilyenek például az enzim katalizált reakciók [49] Elektrokémiai jelátalakítók Az elektrokémiai jelátalakítók a megfigyelt rendszer valamely elektromos tulajdonságának időbeli megváltozását követik nyomon. Vizsgálhatják a rendszerben ébredő potenciálkülönbséget (potenciometria), a rajta átfolyó áram mértékét (amperometria) illetve annak vezetőképességét (konduktometria) is [50]. A következőkben mindezekre egy-egy, napjaink kutatásait meghatározó példát olvashatunk. a.) b.) ábra: a.) A térvezérlésűtranzisztor alapú nanovezeték vezető képességét [51] míg b.) a nanopórusok esetén a pórusok átmérő jét, így az átfolyó ionáramot, [52] szabályozzák a felismerőelemek által megkötött célmolekulák. A töltésérzékeny jelátalakítók vezetőképességét módosíthatja a felismerő elemek által megkötött célmolekulák töltésállapota. Napjaink egyik legígéretesebb, és az irodalomban legtöbbet említett tagja a térvezérlésűtranzisztor (ang. field effect transistor - FET) alapú nanovezeték (ang. nanowire - NW) érzékelők ( a. ábra). Nanoméretűkollektorukat és 21

22 emitterüket egy néhány nanométer átmérőjű félvezető szál köti össze, mely vezetési tulajdonságait töltésük révén, a felületéhez csatolt felismerő elemek által megkötött célmolekulák kapuzzák. A módszer olyan érzékeny, hogy segítségével fehérjéket, DNS szálakat, sőt akár önálló vírusokat is detektálhatunk. Tömbökbe rendezve ezeket nagy teljesítményűanalízist és párhuzamos méréseket is végezhetünk velük [51]. Egy másik nagy erőkkel kutatott és rendkívül ígéretesnek tűnő jelátalakító eljárás a nanopórusokkal (ang. nanopore - NP) való érzékelés. Egy néhány nanométer átmérőjű póruson (csatornán) átfolyó ionáramot a pórus belsejébe kémiai úton csatolt felismerőelem által megkötött célmolekula módosíthatja úgy, hogy térfogatával jelentősen csökkenti a csatorna keresztmetszetét, így az átfolyó áram mértékét is ( b. ábra) [52]. Kutatók nagy áttörést remélnek az ún. nanopórus jelátalakítóktól a biológiai érzékelés területén. Alkalmazásukkal már a legkisebb molekulák detektálhatók, az áhított cél azonban a jelölésmentes szupergyors és olcsó DNS szekvenálás megvalósítása [31]. A korszerű elektrokémiai érzékelés egy harmadik fontos példája az impedancia spektroszkópia (ang. impedance spectroscopy - IS). Működésének alapja, hogy a felismerő elemek redox-aktív csoportjainak egy mérőelektródhoz képesti elhelyezkedése megszabja a rendszer ellenállását [35]. A célmolekulák a váltóárammal hajtott elektródhoz csatolt felismerő elemek konformációját bekötődésükkel megváltoztatják, mely következtében a mért impedancia spektrum (Nyquist-diagram) módosul. Ezen változás nyomon követése a mérés alapja Optikai jelátalakítók A jelölésmentes jelátalakítók piaci versenyét tekintve az optikai módszerek lényegesen keresettebbek társaiknál [43]. Ennek oka főként az, hogy ezek a mérési eljárások a fenti módszerek előnyeit költséghatékony módon egyesítik. A célmolekula bekötődési eseményeket kis teljesítményű elektromágneses mező segítségével roncsolás- és egyéb mellékhatásmentesen azonnal és nagy mintavételezési frekvencia mellett detektálhatjuk. Az ilyen jelátalakítók felületegységre jutó érzékenysége kiemelkedően jó, továbbá könnyebb tömbbe rendezhetőségük révén számos mérés végezhetővelük párhuzamosan [7], valamint érzékelőfelületeik kialakításának technológia igénye relatíve alacsony. Az optikai jelátalakítók működésének alapja, hogy a magasabb permittivitású célmolekulák bekötődésükkel kiszorítják a jelátalakító felületén elhelyezett felismerőelemeket körülvevő közeg (általában valamilyen puffer oldat) alacsonyabb permittivitású molekuláit, így e fizikai mennyiségek átlagos értékét eltolják a felületközeli rétegben. A permittivitás és a vele arányosságban álló fizikai mennyiségek (a haladó elektromágneses mezőfázissebessége, 22

23 polarizációs állapota, a rendszeren áthaladó fény intenzitása, hullámhossza, stb.) a megkötött célmolekulák mennyiségével arányosan változik. (ld.: 13. Függelék Fényterjedés közegben és közeghatáron ) Az optikai jelátalakítók e különbséget formálják mérhetőjellé [7, 53]. A következőalfejezetek, terjedelmi korlátok miatt, csupán a legismertebb és legsikeresebb, a fény polarizációs állapotának vagy fázissebességének megváltozását mérő optikai jelátalakítók rövid bemutatására összpontosítanak. A megadott hivatkozásokban további részletezőleírást találhat az olvasó. Spektroszkópiai ellipszométer Az optikai jelátalakítók egyik csoportja a vizsgált, felismerőelemekkel ellátott felületet felülről, lézer, LED, vagy izzólámpa fényével világítja meg, majd a reflektált vagy a transzmittált nyaláb a beesőfénysugárhoz képesti polarizációváltozását méri. (ld.: Az ellipszometria ) E csoport egyik közkedvelt tagja a spektroszkópiai ellipszométer (ang. spectroscopic ellipsometer - SE). Számos típusa közül a legnépszerűbbek a forgó polarizátoros (RPE), a forgó analizátoros (RAE) és a forgó kompenzátoros (RCE) készülékek [54]. E műszer felépítését tekintve két állítható dőlésszögű, azonos síkban fekvőoptikai karból, egy finoman pozícionálható optikai asztalból, valamint a vezérlőés feldolgozó elektronikai elemekből épül fel. Az optikai karok egyike a fényforrást és a polarizátort, a másik pedig az analizátort és a detektort foglalja magában. A fényforrás prizmával monokromatizált fénye a forgó polarizátoron áthaladva az épp aktuális polarizátor azimutszögnek megfelelősíkban lineárisan polarizálttá válik. Ezt követően a mintára vetődik, ahol is a fény-anyag kölcsönhatás következtében polarizációs állapota megváltozik. (Általában elliptikusan polarizálttá válik.) A mintáról a sugár az analizátorra reflektálódik, ahol az ezen áthaladni képes fényhányad végül bejut a detektorba. ( ) ábra: Spektroszkópiai ellipszométer sematikus vázlata a vizsgáló fény megfelelő polarizációs állapotainak megjelölésével. 23

24 Mach-Zender interferometéter Az interferométerek működési elve, hogy a rendszerébe jutó fényt két egymástól független útvonalon juttatja el a detektorig, ahol azokat interferáltatva a két nyaláb mérőés referencia ágak fáziskülönbségéről kaphatunk információt. (ld.: Interferencia ) Interferometria alapú, jelölésmentes bioérzékelésre alkalmas eszközök közül mindenképp a legismertebbek közé tartoznak a Mach-Zender interferométer alapú eljárások [55]. Az ilyen műszerek működésének alapja, hogy a mérőágukban haladó fény a kívánt biológiai oldaton, a mintán halad át, miközben a referencia ágban haladóhoz képest fáziseltolódást szenved ( a. ábra). Amennyiben az oldat optikai sűrűsége változik, a detektált interferencia intenzitás is ezzel arányosan módosul. a.) b.) ábra: a.) Mach-Zender interferométer b.) Young interferométer mű ködési vázlata [56]. Young interferométer Számos optikai módszer gyakran kihasználja, hogy szilárd közegben, a teljes visszaverődés következtében csapdában tartott fény az őt fogvatartó közeg környezetével, evaneszcens mezejének segítségével kölcsönhat és az ott végbemenőváltozásokra érzékenyen, fázisának eltolódásával reagál. Mivel az ilyen típusú jelátalakítók érzékelőfelületétől távolodva az evaneszcens mezőintenzitása exponenciálisan csökken (ld.: Hullámvezetés izotróp közegben ), ezért a műszerek tipikusan csupán néhány száz nanométer mélyen képesek belelátni a vizsgált felismerőelem - célmolekula rendszer térfogatába. Ennek okán az ilyen jelátalakítók csakis a közvetlen környezet változását detektálják [7]. Ezen elsőpillantásra hátrányosnak tűnőtulajdonságból szakavatott kezekben előnyt kovácsolnak. Horváth et al. [57] például megmutatta, hogy a hullámvezető struktúra paramétereinek megfelelő 24

25 beállításával az evaneszcens mező behatolási mélysége megnövelhető, illetve finoman hangolható sík dielektromos hullámvezetőkben. A Young interferometerek a következőképpen kombinálják az interferencia és a hullámvezetés nyújtotta lehetőségeket. A hordozó felületén kialakított Y alakú hullámvezetőstruktúra a becsatolt fényt két párhuzamosan haladó módusra osztja fel. Az egyik, mint mérőág, az érzékelőfelület alatt elhaladva evaneszcens mezejével letapogatja azt, miközben fázisa a referenciaágban terjedőéhez képest eltolódik. Ezt követően a hullámvezetőstruktúrából, egymás szomszédságában kilépőmódusok interferálnak, majd az általuk létrehozott interferencia mintázatról CCD kamerával készítünk pillanatfelvételeket. ( b. ábra) A szenzorfelületen végbemenőváltozások az alatta terjedőmódus fázisát, így az interferencia mintázat intenzitás minimum és maximum helyeit eltolják, melyből visszakövetkeztethetünk a vizsgált folyamat paramétereire [56]. Dupla polarizációs interferométer Napjaink vezetőjelölésmentes optikai mérési eljárása, a Young interferometria elvén alapuló dupla polarizációs interferometria (ang. dual polarization interferometry - DPI). Működési elve nagyon hasonló a Young interferométerekéhez, különbséget csupán a hullámvezető struktúra elrendezésében mutat. ( a. ábra) A lézer fényforrás síkban polarizált fényét két egymásra rétegzett hordozó - hullámvezetőstruktúra oldalára irányítjuk, és így egyszerre mindkettőbe becsatoljuk. Az alsó hullámvezetőt a felette lévőstruktúra a felületi biológiai rétegben történő változásoktól leárnyékolja, így az előbbi referenciaként, utóbbi pedig érzékelőként szolgál. A hullámvezetőszerkezet másik felén kilépőmódusok interferálnak egymással, majd az interferencia mintázatot egy alkalmas CCD detektorral felvesszük. Mivel a felső érzékelő hullámvezetőfelszínén végbemenőváltozások a benne terjedőmódus fázisát eltolják, azonban az alsó referencia hullámvezetőmódusának fázisa ettől független, az interferencia mintázat minimum és maximum helyei elcsúsznak. E változás mértéke hordozza az információt a vizsgált folyamatról [58]. Optikai hullámvezetőfénymódus spektroszkóp Az elsőhullámvezetésen alapuló érzékelőt Tiefenthaler és Lukosz mutatta be 1984-ben [59]. Azóta már számos más összeállítás is bizonyította, hogy az integrált optikai sík dielektrikum hullámvezetők kiválóan alkalmasak szenzorikai feladatok ellátására. Ezek közül az egyik legismertebb eljárás, mely hatékonyan használja ki a hullámvezetők kivételes felületérzékenységét, az optikai hullámvezető fénymódus spektroszkópia (ang. optical 25

26 waveguide lightmode spectroscopy - OWLS). Elrendezése a következő: Egy sík hullámvezető struktúrát egy rendkívül finoman forgatható goniométer asztalra helyezünk, majd egy lézerfényforrás fényét polarizáció forgatón keresztül a hullámvezetőn található optikai rácsra irányítjuk. A hullámvezetőkét végére egy-egy fotodiódát illesztünk, s ezek segítségével mérjük a beesési szög függvényében a fényintenzitást. ( b. ábra) Annál a beesési szögnél, ahol a fény képes a hullámvezetőbe becsatolni, azaz módust indítani, intenzitáscsúcsot mérünk a detektorokkal. Ez a pozíció azonban a beesőfény hullámhosszán és a rács periódusán túl függ a rétegek opto-geometriai paramétereitől, azaz a rendszer effektív törésmutatójától is. (ld.: Hullámvezetés izotróp közegben ) Amennyiben a fedő, film és hordozó közegek optikai sűrűsége állandónak tekinthető, a felületen fejlődő vékonyrétegben végbemenőváltozás a móduscsúcsok pozíciójának folyamatos mérésével követhető[12] ábra: a.) A dupla polarizációs interferométer (DPI), b.) az optikai hullámvezető fénymódus spektroszkóp (OWLS) és c.) a Kretschmann-féle felületi plazmon rezonancia spektroszkóp (SPR) berendezések vázlata [1, 58, 60]. 26

27 Felületi plazmon rezonancia spektroszkóp A hivatkozásokat és az eladási statisztikákat tekintve minden idők legsikeresebb optikai jelátalakítói a felületi plazmon rezonanciát (ang. surface plasmon resonance - SPR) kihasználó spektroszkópiai berendezések [53]. E műszerek működési elve, hogy egy vékony aranyréteg felületről teljes visszaverődést szenvedőlézerfény evaneszcens mezeje felületi plazmonokat (hideg elektronplazma rezgésének kvázirészecskéi) gerjeszthet a fémréteg felületén. SPR technológia alkalmazása esetén a fémfelületrő l reflektálódó fény intenzitásának szögfüggését mérik. A c. ábrán látható, ún. Kretschmann elrendezésben egy prizmához törésmutató illesztőfolyadékkal egy olyan üveghordozót rögzítenek, mely túlsó felületére előzőleg arany vékonyréteget választottak le. A bioérzékelés folyamata az aranyréteg felületén, folyadékcella alatt megy végbe. A fémrétegre fókuszált és innen visszaverődőfény intenzitása egy adott a felületi plazmonokat gerjesztő szögnél leesik, melyből meghatározható a vékonyréteg effektív permittivitása. E fizikai paraméter megváltozása kapcsolatba hozható a bekötődő célmolekulák mennyiségével [1] I. táblázat: Legelterjedtebb és legnépszerűbb mérési eljárások érzékenységét összefoglaló táblázat Eljárás Maximális érzékenység Nem optikai jelátalakítók Kvarc-kristály mikromérleg Felületi akusztikus hullámok Mikromechanikus erőkar* Nanovezeték* Nanopórus* Impedancia spektroszkópia* 5 pg/mm2 3 pg felbontás Passzív mód: egyetlen sejt Dinamikus mód: pm DNS Egyetlen vírus Egyetlen DNS Oligopeptid konformáció vált. Optikai jelátalakítók Spektroszkópiai ellipszométer Young interferométer Dupla polarizációs interferométer Optikai hullámvezetőfénymódus spektroszkóp Felületi plazmon rezonancia spektroszkóp törésmutató ~10-4 ~10-6 ~10-7 ~10-5 ~10-5 tömeg / felület ~10 pg/mm2 0,1 pg/mm2 10 pg/mm2 ~10 pg/mm2 Referencia [46] [61] [62] [62] [62] [35] saját mérések [56] [15] [63] [64] * Ezen eljárások egyetlen sejtet, molekulát, vírust, vagy DNS-t képesek detektálni egyetlen jelátalakító szegmensen, azonban ezen szegmensek kicsiny mérete hátrányt jelent bizonyos gyakorlati alkalmazásokban (pl.: komplex oldatok esetén leárnyékolás, nagy diffúziós időa szenzorfelületre). 27

28 6. Flagelláris filamentum alapú érzékelőrétegek minősítése A spektroszkópiai ellipszometria, mint roncsolásmentes optikai mérési módszer ahogyan azt a jelen fejezet bemutatja alkalmas összetett szerkezetűflagelláris filamentum fehérjerétegek nagyérzékenységűminősítésére akár összetett, a hullámvezetőszenzorikában is használatos multiréteg szerkezeteken is. A megfelelőoptikai modell megkonstruálásával folyadékcellában történőleválasztás közben meghatározható a felületen épülőréteg tömegsűrűségének időbeli változása, sőt a modell tökéletesítésével megmérhetőe paraméter mélységbeli eloszlása is. Kiderül az is, hogy az így kapott információ alapján becslés adható a flagelláris filamentum vékonyrétegek várható háromdimenziós szerkezetére. Ahogy azt az Flagelláris filamentumok címűfejezetben már tárgyaltuk, a flagelláris filamentumokat alkotó flagellin alegységek külsőrégiója a filamentáris szerkezet károsítása nélkül módosítható. E régiók fehérjeszerkezetét mesterségesen megváltoztatva a filamentumok alkalmassá tehetők célmolekulák specifikus megkötésére. Mivel ezek mindegyikét több tízezer flagellin alegység alkotja, rendkívüli felületi felismerő elem sűrűséget érhetünk el úgy, ha e fehérjéket a megfelelőimmobilizációs technikával a választott jelátalakító érzékelő-felületéhez rögzítjük. A flagelláris filamentumok alkotta réteg ugyanis nem kétdimenziós jellegű, hanem a vizsgált oldatba több száz nanométer mélyen benyúló, filamentumokkal sűrűn kitöltött statisztikus elrendeződésű, háromdimenziós rendszer (ld. később). E tulajdonság adja a flagelláris filamentumokkal érzékenyített felületek egyik előnyét a kétdimenziós rétegekkel szemben, hiszen a vizsgált oldat e háromdimenziós szerkezetet térfogatában járhatja át. Hullámvezetőalapú érzékelők ígéretes jelátalakítói az ilyen rendszereknek, tekintve, hogy érzékenységük kiváló, s a felületi réteget vizsgáló evaneszcens mező(ld.: Hullámvezetés izotróp közegben ) karakterisztikus vastagága tág határok között (~ 100 nm-től ~ 1000 nm-ig) hangolható [57, 60], így a filamentáris rétegnek megfelelően optimalizálható. A flagelláris filamentumok előnyös tulajdonsága továbbá, hogy gyorsan és költséghatékony módon termeltethetőek baktériumokkal, melyekről azután a sejtek feltárása nélkül leválaszthatóak. Elkülönítésükhöz nem szükségesek olyan bonyolult tisztítási és szűrési folyamatok, melyek például az antitest felismerőelemek előállítását jellemzik. Fontos előnyös tulajdonságuk például a mikrotubulus vagy más biopolimer rendszerekkel szemben a rendkívüli kémiai stabilitásuk. Ennek évmilliárdos 28

29 oka, hogy a baktériumok olyan ostorokat, azaz flagellumokat fejlesztettek ki, melyek ellenállnak az őket körülvevőkörnyezet szélsőséges viszonyainak is. Megbízható, gyakorlatban jól használható bioszenzorok előállításának egyik fontos kritériuma, hogy ellenőrzött módon, jó minőségűfelismerőelem vékonyrétegeket hozzunk létre a jelátalakító érzékelőfelületén. Egyedi, ismeretlen minőségűrétegek ugyanis, csak kvalitatív mérésekre alkalmasak, mennyiségi meghatározásra biztosan használhatatlanok. Kiváltképp így van ez az egyszer használatos érzékelőrétegek esetén. Ott ugyanis még az a lehetőségünk sincsen meg, hogy kalibráljuk ezeket. Rendkívül fontos tehát, egy olyan eljárást kifejlesztenünk, mely minősíteni tudja az előállított rétegeket. Amennyiben e feladat ellátására sikerülne egy alkalmas módszert kidolgoznunk, segítségével nem csupán a fehérjeréteg érzékelő felületre való leválasztásának (immobilizációjának) eredményéről mondhatnánk objektív véleményt, hanem mint visszacsatolásnak a felület kémia paramétereinek optimális beállításában is pótolhatatlan szerepe lenne Ex situ felületanalízis Flagelláris filamentum alapú biológiai érzékelőrétegek fejlesztése során az egyik legfontosabb kérdés az, hogy a fehérjeszálak az immobilizációt követően milyen felületi tömegsűrűség mellett helyezkednek el az érzékelőfelületen. Ennek megválaszolására alkalmasak lehetnek olyan lokális méréstechnikák, mint például az atomerőmikroszkópia (ang. atomic force microscopy - AFM) és a pásztázó elektron mikroszkópia (ang. scanning electron microscopy SEM) is. Járható útnak tűnik az a lehetőség, hogy az ábrához hasonló SEM illetve a.) b.) ábra: A flagelláris filamentumokkal beborított felületrő l készült a.) AFM és b.) SEM felvétel. (Az AFM képeket Dr. Osváth Zoltán, a SEM képeket Dr. Tóth Attila készítette.) 29

30 AFM felvételeket képfeldolgozó eljárás alá vessük. Ez esetben a nehézséget nem csupán a képfeldolgozás jelentené, hanem az is, hogy az anyagmennyiség kvantitatív, makroszkopikus felületméretre érvényes meghatározása e mikro-képek alapján problémás. Hátrányuk továbbá, hogy mindkét eljárás rendkívül idő- és költségigényes, illetve, hogy az ex situ vizsgálatokra történőelőkészítés, s maga a mérés is károsítja a mintákat. Önállóan tehát semmiképp sem alkalmasak a fentiekben megfogalmazott feladat rutinszerűellátására. Optikai módszerek alkalmazásával a flagelláris filamentumok alkotta rétegek minősége gyorsan, egyszerűen, rutinszerűen, nagymennyiségűminta esetén is, akár az érzékelőfelületre való immobilizáció közben is, nagy érzékenységgel mérhetőanélkül, hogy azok bármiféle károsodást szenvednének. A spektroszkópiai ellipszometria olyan nagyérzékenységű polarizációs optikai módszer, amely széles hullámhossztartományban globális információt nyújt a felismerőelem vékonyréteg szerkezeti paramétereiről: vastagságáról, sűrűségéről és akár mélységbeli és laterális homogenitásáról is. Ezen integrális méréstechnika alkalmazásával megfelelőfelületanalízist remélünk megvalósítani, mely kulcsa lehet az érzékelők fejlesztésének és megbízható, reproduktív gyártásának Mintakészítés Immobilizáció A hordozóra porlasztott Ta2O5 film réteget kénsavas fürdőben megtisztítjuk, majd a 2,5 %-os 3-aminopropil-trietoxi-szilán (APTES) - ultratiszta víz oldatba mártva szilanizáljuk ( a. ábra). Ezt követően szárítósütőbe helyezve 2 órán keresztül, 120 C-on szárítjuk a mintát. A szilanizált felszínt keresztkötővel, 2%-os glutáraldehid (GA) és 20 mm-os, 7.4-es ph-jú nátriumfoszfát puffer (PBS) oldatával kezeljük 20 C-on, ugyancsak 2 órán keresztül. Ennek során vízkilépéssel kovalens kötés jön létre az APTES nitrogénje és a GA egyik láncvégi ábra: A fehérje immobilizáció reakciólépései 30

31 szénatomja között ( b ábra). Ezek után a flagelláris filamentumokat (FF) PBS pufferben feloldva 0,3 mg/ml koncentrációjú oldatot készítünk. Ebben 17 órán keresztül áztatjuk a chipet. Ezalatt a fentivel megegyezőreakcióban a GA másik láncvége szintén kovalens kötést alakít ki a rögzíteni kívánt fehérjével ( c ábra). Az oldatból kiemelve ultratiszta vízzel leöblítjük a mintát. E vegyi folyamat után a ábrán látható vékonyréteg struktúrát kapjuk [65]. Hordozó választás A rácscsatolt interferométerben használatos hullámvezetők hordozó rétege átlátszó dielektrikum, amorf SiO 2, mely kedvezőoptikai és mechanikai tulajdonságai révén alkalmas eleme ezen egységeknek. Az ellipszometria szempontjából azonban kellemetlen választás, hiszen nem tekinthető félvégtelen közegnek. Az erre épített vékonyréteg-rendszer ellipszometriai spektruma, a hátoldali reflexió következtében, a függelék Az ellipszometriai modellek alapjai alfejezetében bemutatott matematikai módszert alkalmazó algoritmusokkal (csak úgy, mint az általunk használt WVASE 32 v programmal) kiértékelhetetlen. E kellemetlenség orvosolható, ha valamilyen módon megszüntetjük a hátoldalról való fényvisszaverődést. Jelen kísérletsorozatban ezt úgy valósítottuk meg, hogy a hullámvezetőrétegszerkezetét módosítottuk: A minták egyik csoportjában az eredeti SiO2 hordozót szilícium hordozóra növesztett, 200 nm vastag, termikus SiO2-dal helyettesítettük, a másikban pedig csupán natív oxidréteggel rendelkezőszilícium hordozóra cseréltük. Az új hordozókra, a közönséges hullámvezetők gyártásával analóg módon, elektronsugaras porlasztással 200 nm vastagságú Ta2O5 hullámvezetőréteget gőzölünk. Ezt követően 3aminopropil-trietoxi-szilán (APTES) és glutáraldehid keresztkötő (GA) segítségével a flagelláris filamentumokat (FF) a Ta 2O5 film felületéhez rögzítjük. A szilanizálás ábra: A flagelláris filamentum felismerőelemekkel borított hullámvezetőszenzor vékonyréteg-struktúrája, és ennek szükséges módosítása a spektroszkópiai ellipszometirával történőszerkezetanalízishez. 31

32 idejét optimalizálandó, a két csoport hat-hat mintáját rendre 5, 10, 20, 30, 40, 60 perc szilanizálási időnek vetettük alá. Az eljárás a ábrán látható rétegszerkezetet eredményezi. A fenti kísérlet elvégzésével a következőkérdésekre kívántunk választ kapni: Alkotható-e optikai modell e rétegszerkezet ellipszometriai elemzéséhez? Ha igen, a modellel kapott értékek, milyen viszonyban állnak az irodalmi referenciaértékekkel? Milyen érzékenyen mérhetjük e rétegek opto-geometriai paramétereit? A kapott értékekből milyen következtetéseket vonhatunk le? Hatással van-e a termikus SiO2 réteg a mérés érzékenységére? Jellemzően mennyi az a szilanizálási idő, melynél több már nem növeli a megkötött filamentumok számát? Feladatom egy olyan optikai modell megalkotása volt, mellyel a fentiekben ismertetett vékonyréteg-rendszerről készült ellipszometriai spektrumok egyértelműen kiértékelhetők, illetve, hogy a kapott paraméter értékek megfelelőösszegzésével választ adjak az előbbi kérdésekre. Az eredmények vegyészeti értelmezése nem volt része a feladatkörömnek Modellalkotás és spektrum kiértékelés A fentiekben ismertetett vékonyréteg-rendszer Sopra ES4G ellipszométerrel, 75 -os beesési szög mellett, nm-es hullámhossztartományban mért spektrumainak analízisére nem csupán egyetlen optikai modellt gondolhatunk alkalmasnak. Azt, hogy ezek közül mégis melyik a legmegfelelőbb kiértékelési mód, az illesztőprogram által számított paraméterek hibáinak nagysága és az illesztés minőségét megadó MSE* (mean square error négyzetes középhiba) értékek összehasonlításával dönthetjük el. Az előbbiből elsősorban arra következtethetünk, hogy a modellben szereplőváltozók mennyire korrelálnak. Az utóbbiak főleg a mért, spektrumokra való modellillesztés jóságát jellemzik. Mivel minden minta esetén, a gyártási folyamat a Ta2O5 réteg felületre való porlasztását követő minden egyes * MSE (mean square error négyzetes középhiba) N meas calc meas calc 1 j j j j MSE meas meas N P 1 j 1 j j ahol N az ellipszometriai mérés során az adott hullámhosszon vett független leolvasások száma, P a modell ismeretlen paramétereinek mennyisége, meas, meas a mért, ellipszometriai szögek, calc, calc a modellből számolt meas pedig a független mérések eredmények szórása. Az 10 alatti MSE értékkel jellemezhetőillesztést szokás a szakirodalomban kiválónak nevezni. 32

33 fázisa utáni állapotról készült spektroszkópiai felvétel, a kiértékelés során lehetőségem volt lépésről-lépésre haladni. Így tehát először a {Si - termikus/natív SiO2 - Ta2O5} struktúra spektrumait elemeztem, majd a későbbieket már ezek rögzített paraméter értékeinek ismeretében vizsgáltam tovább. A már megkapott részeredményeket előre görgetve segíthető az újabbak biztosabb meghatározása. Ezzel egy sokváltozós rendszer több független mérés bevonásával kisebb paraméterbizonytalansággal értékelhetőki. Érdemes a kiértékelést a {Si - natív SiO2 - Ta2O5} mintákról készült spektrumokkal kezdeni. Itt ugyanis a natív oxid réteg vastagságáról jogosan feltehetjük, hogy lényegesen kisebb, mint a Ta 2O5 rétegé, ezért a spektrumot a két szélsőanyag fogja meghatározni. A modell alkotás során először az irodalmi törésmutató adatokra, azaz a tömbi anyagokon végzett referenciamérésekre támaszkodtam, azonban az ezekkel történőillesztés hatalmas MSE értékre vezetett. Ez azt az elképzelést erősíti meg, hogy a gőzölés amorf Ta2 O5 réteget hoz létre a hordozó felszínén, így nem illeszthetők rá az irodalmi, kristályos Ta2O5-ra vonatkozó referencia értékek. Az irodalmi Ta2O5 rétegmodellt egy általános, szilárd, izotróp szigetelőkre vonatkozó Cauchy dielektromos függvénnyel* (ld.: Fontosabb ellipszometriai rétegmodellek ) helyettesítetve az illesztések MSE értékei lezuhantak, míg az illesztett paraméterek érzékenységei nem romlottak (a paraméterillesztés hibája nem növekedett), továbbra is 0,1-0,5 % között maradtak. Ezek után következhettek azok a minták, melyek natív helyett termikus oxidréteget tartalmaztak. Az oxidréteg modellezésére az irodalmi SiO 2 referencia értékeket használtam fel, mellyel ennek tipikus vastagságára 216,4 ± 5,9 nm-t kaptam. E mintákon mért átlagos Ta2O5 rétegvastagság és a hullámvezetőtechnikákban érdekes, He-Ne lézer fényforrások 632,8 nm-es hullámhosszán mért átlagos Ta2O5 törésmutató érték a natív oxid alapúakéval egybe esett. Ezen értékek rendre 186,2 ± 2,2 nmnek és 2,136 ± 0,019-nek adódtak. A ábrán egy-egy tipikus illesztés eredményét láthatjuk. Az imént kapott paraméterek és azok hibái alapján megállapíthatjuk, hogy az elektronsugaras porlasztással történőta2o5 rétegleválasztás jól kézbentartott, megfelelően precíz eljárás, mely *A függelék alfejezetében részletesen tárgyalt Cauchy függvény elsőhárom tagját tartjuk meg, a többit elhanyagolhatóan kicsinek tekintjük. Ezzel az egyszerű sítéssel a Cauchy dielektromos függvény a következő alakot ölti: B B n B Az illesztendőparaméterek: B 0, B1, B2 33

34 a.) b.) ábra: A natív (a.) és a termikus (b.) oxidrétegeket tartalmazó minták spektrumai és az illesztett optikai modell. (A szaggatott vonalak a kísérleti, a folytonosak a számított spektrumot jelölik.) során amorf, magas törésmutatójú vékonyréteg kerül a hordozó felszínére. Mindez a hullámvezetőalapú érzékeléstechnikák szempontjából azért rendkívül fontos eredmény, mert amorf anyagban nincsenek kitüntetett irányok, melyek esetleg a módusterjedést befolyásolhatnák, illetve a magas törésmutató tágabb tartományokban való érzékelést tesz lehetővé (ld.: 7. Rácscsatolt interferométer ). Annak következményeképp pedig, hogy egy, a fényabszorpciót figyelmen kívül hagyó optikai rétegmodellel illeszthetőa mintáról készült spektrum a következőt állíthatjuk: bár amorf anyagban a direktátmenetnél lévőabszorpciós csúcs kiszélesedik, itt fotonenenergiában még mindig annyira távol vagyunk a tiltott sávtól, hogy elhanyagolható az elnyelés. Ilyen hullámvezetőrétegek alkalmazásával tehát kis veszteségűmódusterjedés valósítható meg. A gyártási folyamatban következő, szerves anyagok esetén irodalmi referenciákra nem támaszkodhatunk, így célravezetőnek az látszott, ha ebben az esetben is Cauchy függvényt alkalmazunk a rétegek opto-geometriai paramétereinek meghatározására. Már az első illesztések után világossá vált, hogy az APTES film vastagsága oly kicsi, valamint optikailag annyira összeolvad az alatta található Ta2O5 filmmel, hogy mint önálló réteg nem értékelhető. Ha ezt mégis megpróbáljuk, a modell-paraméterek bizonytalansága olyannyira megnő, hogy bármineműkövetkeztetés értelmetlenné válik. A következőmegoldást választottam tehát: változatlannak feltételezett SiO2 vastagság mellett az előbbi, {Si - SiO2 - Ta2O5} rétegrendszerre alkalmazott modellt illesztettem a soron következő{si - SiO2 - Ta2O5 APTES} struktúra spektrumára is. A paraméterek hibái így rendre 1% alá kerültek, valamint az illesztés minőségét jellemzőmse értékek szigorúan mérve is elfogadhatóak maradtak továbbra is. E modellel azonban az APTES réteg vastagságát (csak) úgy becsülhetjük, ha az 34

35 I. táblázat: Natív és termikus oxidréteg alapú {Si - SiO2 - Ta 2O5 - APTES} vékonyréteg-szerkezetek spektrumának kiértékelésébő l kapott átlagos APTES rétegvastagságok (daptes), illetve a Cauchy réteg megváltozott törésmutató értékei. Mintacsoport daptes n Ta2O5 - APTES (632,8 nm) MSE {Si - natív SiO2 - Ta 2O5 - APTES} 0,7 ± 0,1 nm 2,122 ± 0, {Si - termikus SiO2 - Ta 2O5 - APTES} -0,2 ± 0,2 nm 2,141 ± 0, újonnan kapott paraméterértékekből kivonjuk a régieket. A törésmutató esetében azonban csak a teljes Cauchy rétegbeli átlagos megváltozását detektálhatjuk. Mindezek alapján a I. táblázatban összefoglalt eredményekre jutottam. Az APTES réteg vastagsága a natív oxidos minták esetén átlagosan 0,7 nm, ami egybe esik a monomolekuláris APTES film irodalmi vastagságával [66] A termikus oxidréteg alapú minták esetén azonban ez az érték negatívnak adódik. Ebből arra következtethetünk, hogy valamilyen ismeretlen oknál fogva, a szilanizálási eljárás következményeként, a termikus oxid réteg tulajdonságai megváltozhatnak, melyet az illesztés a felette lévő réteg vastagságának csökkentésével kompenzál. Dr. Hámori András hullámvezetőchipeken végzett OWLS mérései is megerősítették azt az állítást, miszerint a termikusan hőkezelt minták szilanizálása esetén annak ellenére, hogy a felületen rétegépülés történik a négyrétegű modell módusegyenletével számolt adlayer vastagságra negatív értéket kapunk. ( ábra) E furcsa paradoxon magyarázatára vegyész kollégáim számos teóriát is megvizsgáltak, azonban a jelenség oka mindmáig megválaszolatlan maradt. a.) 0.2 b.) 0.2 SE mérések: 0.1 OWLS mérések: d A / nm d / nm Mintaszám Szilanizálás idõtartama / perc ábra: Termikus oxid alapú minták esetén, az APTES rétegek vastagságára kapott értékek grafikus ábrázolása. a.) SE mérések illetve b.) OWLS mérések alapján. 35

36 A gyártási folyamat következőfázisa, mikor a mintákat GA keresztkötővel kezeljük. Ennek során ugyancsak egy optikailag nehezen elkülöníthető, monomolekuláris réteg épül a felületre, következésképpen a modell és a vele való spektrumkiértékelés menete teljesen megegyezik az előzőlépésben tárgyaltakkal. Az ide vonatkozó eredményeket a II. táblázat foglalja össze. Láthatjuk, hogy az átlagos rétegvastagságok a natív és termikus oxidréteg alapú minták esetén ugyan nem egyeznek, de rendre pozitív értéket vesznek fel. Ez az eltérés vélelmezhetően még a fentiekben tárgyalt effektussal függhet össze. Pontos kémiai magyarázatot ez esetben sem kaptunk II. táblázat: Natív és termikus oxidréteg alapú Si - (SiO2 ) - Ta 2O5 - APTES - GA vékonyréteg-szerkezetek spektrumának kiértékelésébő l kapott átlagos GA rétegvastagságok (dga) illetve a Cauchy réteg megváltozott törésmutató értékei. Mintacsoport dga n Ta2O5 - APTES - GA (632,8 nm) MSE {Si - natív SiO2 - Ta 2O5-APTES - GA} 0,7 ± 0,2 nm 2,120 ± 0, {Si - termikus SiO 2 - Ta 2O5 - APTES - GA} 0,2 ± 0,1 nm 2,143 ±0, Elérkeztünk a kiértékelés utolsó szakaszához, a flagelláris filamentumok rögzítése után mért spektrumok elemzéséhez. Amennyiben feltesszük, hogy a fehérjeréteg optikailag elválasztható az alatta található rétegektől, érdemes egy újabb Cauchy dielektromos függvényt beépítenünk a fentiekben alkalmazott rétegmodellbe. Amennyiben ezt nem feltételezzük, élhetünk a fentiekben már jól bevált eljárással, mikor ugyanazzal a modellel illesztve a spektrumokat az új és a régi paraméterek összehasonlításából próbálunk következtetéseket levonni. A kiértékelés során mindkét lehetőséget megvizsgáltam, s a következőkre jutottam: A filamentumréteget külön Cauchy függvénnyel modellezve kisebb MSE és jól elkülönülő törésmutató értéket kaptunk. A fentiek eredményeképp levonhatjuk azt az egyértelművégkövetkeztetést, miszerint ezen összetett jelátalakító - felismerőelem rétegszerkezetről készült ellipszometriai spektrumok elemzéséhez Si - SiO2 - Cauchy - Cauchy modellt érdemes használni. A ábrán e modellel való illesztés egy-egy jellemzőeredményét láthatjuk. Az illesztések tipikus hibáját és a modell paraméterek jellemző bizonytalanságát elemezve arra jutottam, hogy az ellipszometriai mérések a natív oxidos minták esetén érzékenyebbek. 36

37 a.) b.) ábra: A {Si - SiO2 - Ta 2O5 - APTES - GA - FF} vékonyréteg-struktúrák esetén a legjobb optikai modellnek a Si - SiO2 - Cauchy - Cauchy rétegmodell-szerkezet bizonyult. Az ezzel történőillesztés egy jellemzőeredményét figyelhetjük meg az ábrákon a.) natív oxid alapú és b.) termikus oxid alapú minták esetére. A szilanizálási idő, mint fontos technológiai paraméter hatását is vizsgálhatjuk, amennyiben a kapott rétegvastagságokat a kezelés idejének függvényében ábrázoljuk. ( ábra) Láthatjuk, hogy egy-egy pont kivételével a rétegvastagságok jó közelítéssel azonosak, tehát nem függnek a szilanizálás időtartamától. Mivel a két sorozatot összevetve a két kiugró pont helyzete nem mutat semmiféle tendenciát, mintakészítési hibának tekinthetjük ezeket. Ezeket elhagyva elmondható, hogy az immobilizációs eljárás során készített érzékelőrétegek legalábbis azonos típusú hordozók esetén jól reprodukálhatók, a rétegépítés vastagságbizonytalansága 3% alatt van. Az egyedi vastagság és törésmutató értékek az III. táblázatban látható átlagokra vezetnek. Si - SiO2 - Ta2 O 5 - APTES - GA - FF Si - Ta2O 5 - APTES - GA - FF FF réteg vastagsága / nm A szilanizálás idõtartama (perc) ábra: FF rétegvastagságok a szilanizálási időfüggvényében. Egy-egy kiszóró pont kivételével a vastagságok érzéketlenek a szilanizálás id ő tartamára. 37

38 III. táblázat: A ábrán látható két kiugró pontot elhagyva, a FF rétegek átlagos paraméterei láthatók a lenti táblázatban. Mintacsoport dff n FF (632,8 nm) MSE {Si - natív SiO2 - Ta 2O5 - APTES - GA - FF} 14,2 ± 0,4 nm 1,411 ± 0,022 6 {Si - termikus SiO2 - Ta 2O5 - APTES - GA - FF} 10,5 ± 0,2 nm 1,526 ± 0, A natív oxidréteg alapú minták esetében vastagabb, de kisebb törésmutatójú fehérjeréteg épül a minta felületére, mint a termikusak esetén. Mivel a törésmutató a réteg tömörségével arányos mennyiség, elmondhatjuk, hogy natív oxidos minták esetén ritkább közeget kaptunk. Ennek kémiai magyarázatát még nem sikerült megtalálnunk, azonban feltételezhetjük, hogy ez is visszavezethetőa szilanizálás során bekövetkezőoptikai tulajdonság-változásra. A felületre levált anyag mennyisége arányos rétegvastagságának és törésmutatójának szorzatával [67]. Bár az arányossági tényezőesetünkben nem ismert, a két mintacsoportra jellemzőszorzatok hányadosából meghatározható az anyagmennyiségek aránya, melyre nagyon jó közelítéssel 1-et kapunk. Ennek tükrében kijelenthetjük, hogy a felületre leválasztott anyag mennyisége azonos a kétféle hordozó esetén. Megjegyzendő, hogy Dr. Kurunczi Sándor vizsgálatai arra engedtek következtetni, hogy a filamentumok valóban kovalens kötéssel rögzülnek a felülethez. Ezt úgy sikerült bizonyítania, hogy a kész chipek felszínét detergenses, 0,1 M HCl, illetve 8 M urea oldattal való kezelést követően ellipszométerrel visszamérve, jelentős változást nem tudott kimutatni a fehérjeréteg vastagságában In situ felületanalízis Az előzőalfejezetben megmutattam, hogy a spektroszkópai ellipszométerrel mért spektrumok a kifejlesztett optikai modellel kiértékelve választ adhatnak számos, a felismerő elem vékonyréteg minőségére vonatkozó kérdésre. Az eddigiek nem hangsúlyozott egyik hiányossága azonban az volt, hogy a fehérjeréteget csupán a leválasztás végeztével, ex situ volt módunk minősíteni. A leválasztás közbeni ellenőrzés azonban lehetőséget adna a fehérje oldatbeli vizsgálatára. Valós idejű mérésekkel pedig tanulmányozhatnánk a rétegépülés kinetikáját, valamint a kívánt felületi tömegsűrűséget elérve azonnal megszakíthatnánk az immobilizációt. Ezzel jelentékeny mértékben csökkenthetnénk a selejtek számát, javíthatnánk az ismételhetőséget és így a megbízhatóságot is. A Sopra ES4G készülék 20 perces spektrum mintavételezési ideje azonban nem teszi lehetővé az ilyen jellegűvizsgálatokat. 38

39 A 2009-es év legelején az MFA Fotonika osztályán üzembe helyezték az akkor kereskedelmi forgalomban elérhető, legkorszerű bb spektroszkópiai ellipszométer típusok egyikét, a Woollam cég M2000DI típusú forgó kompenzátoros műszerét [68], mely számos tekintetben felülmúlja az addig használt Sopra ES4G készüléket. Ezek közül csak néhányat említve: A fejlesztő mérnökök az eszköz fényforrás és detektor fejeit automatikus goniométerre rögzítették, így os beesési szögtartományban az ellipszométer átszerelése nélkül, gyorsan és könnyedén mérhetünk. Automatikus kollimátora segítségével a mintapozicionálás pillanatok műve. Kombinált fényforrása révén sokkal szélesebb, 190 nm nm-es hullámhossztartományban vehetünk fel ellipszometriai spektrumokat. A legfontosabbak azonban, hogy nagy mintavételezési sebességének ( 2 másodperc) köszönhetően akár valós idejűvizsgálatokra is alkalmazhatjuk, illetve, hogy forgó kompenzátora révén érzékenyebb mérésekre képes. A készülékhez tervezett 5 ml űrtartalmú folyadékcella segítségével akár in situ folyamatkövetés is végezhetővele. A cella üvegablakainak mérést befolyásoló hatása a gyártó által javasolt CompleteEASE v.3.79 program segítségével kikompenzálható. A szoftver képes továbbá az átlátszó hordozók hátoldaláról való fényvisszaverődést számításba venni, így a jelátalakítókban használt, amorf SiO 2 alapú hullámvezetőkön való trükkös módosítások nélkül is mérhetünk Előkészületek az in situ kísérletekhez Elsőként fontos volt megvizsgálnom, hogy az új ellipszométer valóban alkalmas-e arra, hogy az átlátszó hordozóra leválasztott film opto-geometriai paramétereit is meghatározza. Új mintákat készítettünk, ezúttal a közönséges hullámvezetőchipekben használatos, amorf SiO2 (Suprasil-1 olvasztott szilika), illetve referenciaként {Si - termikus SiO2} hordozókra gőzöltettünk az előzővel azonos, 200 nm vastag Ta2O5 hullámvezetőfilmet. A szilícium hordozókra növesztett termikus SiO2 vastagságát előzetes szimulációk alapján 20 nm-nek választottuk meg annak érdekében, hogy a lehetőlegérzékenyebb ellipszometriai méréseket végezhessünk a kapott mintákon. Az öt-öt mintát rendre az ellipszométer tárgyasztalára helyeztem, majd ezekről 65, 70, 75 -os beesési szögek mellett spektrumot készítettem. A szilícium alapú hordozók esetére természetesen alkalmazható az előző alfejezetben bemutatott Si - SiO2 - Cauchy modell. Az átlátszó hordozók spektrumainak kiértékeléséhez azonban új modellt kellett keresnem. Mivel az amorf SiO2 dielektrikum, érdemes ismét csak a Cauchy függvénnyel próbálkoznunk. Az így megállapított Cauchy - Cauchy modell segítségével bekapcsolva a program beépített funkcióját, mellyel a hátoldali reflexiót figyelembe vehetjük, kiváló egyezést találtam 360 nm-es hullámhossz érték felett a számolt és 39

40 mért spektrumok között. A későbbiekben olvasható korlátok miatt a méréstartományt mégis nm-nek javasoltam. A Woollam ellipszométer nagyobb érzékenységének következtében a minta felszínén található néhány nanométer vastag felületi érdesség is elkülöníthetőoptikailag. Ennek modellbeli figyelembevételével a számolt és mért spektrumok egyezése tovább javítható. Az ily módon felépített optikai modellek alkalmazásával kapott tipikus illesztések a ábrán láthatók. A szilícium hordozóra növesztett termikus oxid réteg öt mintára vett átlagos vastagságára 16,80 ± 0,45 nm-t kaptam, az amorf SiO2 hordozó átlagos törésmutatóját 1,486 ± 0,006-nak állapítottam meg, melyek jól egyeznek a gyártó által megadott értékekkel. Az egyes paraméterek bizonytalanságát tipikusan legalább egy nagyságrenddel kisebbnek találtam, mint azok átlagérték körüli szórását. Az illesztés hullámvezetőrétegre vonatkozó paramétereit a I. táblázat foglalja össze, mely alapján kijelenthető, hogy a két mintatípus esetére kapott vastagság és törésmutató értékek hibahatáron belül egybeesnek. A tipikus MSE értékek jól tükrözik az illesztések kiváló minőségét. a.) b.) ábra: a.) {Si - SiO2 - Ta 2O5} b.) {amorf SiO2 - Ta 2O5} minták mért spektrumai (minden hetedik mért Ψ-t fekete, Δ-át szürke o szimbólumok jelölnek), illetve a Si - SiO2 Cauchy és SiO 2 - Cauchy modellekkel való illesztés eredményei (fekete és szürke vonalak) I. táblázat A hullámvezető és a referencia minták spektrumaiból a megadott modellekkel kiértékelt Ta 2O5 filmre vonatkozó átlagos paraméterértékek és ezek szórásai. Az illesztések hibáját az utolsó oszlop tartalmazza. Mintacsoport dta2o5 n Ta2O5 - APTES (632,8 nm) MSE {Si - termikus SiO 2 - Ta2 O5} 190,27 ± 0.99 nm 2,128 ± 0,002 3,5 {amorf SiO2 - Ta2 O5} ± 0.93 nm 2,134 ± 0,005 5,9 40

41 Megjegyzendő, hogy a hullámvezetőmodellstruktúrát SiO2 - Cauchy-ra cserélve jelentősen rosszabb egyezést találunk a mért és számított spektrumok között. A megadott beesési szögek helyett 55, 60, 65 -nál mérve számottevően kisebb érzékenységgel határozhatjuk meg a paraméterek értékeit. Második lépésben a hordozókat a 75 -os beesési szögre tervezett, 5 ml űrtartalmú Wollam folyadékcella alá helyeztem ( ábra), s vizsgáltam a két kvarc ablak mérést befolyásoló hatását. A cella azonban olyan jó minőségűkvarc ablakokat tartalmaz, hogy a kiértékelő programba épített, a folyadékcella hatását kompenzáló funkciót (delta offset) az illesztés minőségének megtartásához nem szükséges bekapcsolnunk ábra: Folyadékcella sematikus képe a spektroszkópiai ellipszométer vizsgáló fénynyalábjának megjelölésével [68 ]. A {Si - SiO 2 - Ta2O5} típusú hordozókat a folyadékcellába helyezve, s azt PBS oldattal feltöltve újra felvettem a spektrumokat. A a. ábrára tekintve láthatjuk, hogy hozzávetőlegesen 1100 nm-es hullámhossz felett a mért spektrum fokozódó amplitúdóval oszcillálni kezd. Ennek oka, hogy a feltöltött cellán áthaladó infra tartománybeli sugarak intenzitása útjuk során a detektor érzékenysége alá csökken. Mivel az ellipszométer két külön detektorral méri a 1000 nm felett és alatt a beesőfényintenzitást, a nagyobb megbízhatóság érdekében, a mérési tartományt érdemes nm-nek megválasztani. A spektrumok kiértékelésekor feltétlenül figyelembe kell vennünk, hogy a minta felületének környezete levegőről PBS oldatra változott. Mivel a PBS oldat törésmutatója nem azonos a tiszta vízével (ld.: 8. Rácscsatolt interferométer ) nem alkalmazható annak referencia törésmutató sorozata. Ismét csak a kis diszperziójú közegre általánosan használható függvény, a Cauchy modell az, mellyel a feladat kiválóan megoldható. ( b. ábra) 41

42 a.) b.) ábra: A {Si - SiO 2 - Ta2O5} mintákat PBS-sel feltöltött folyadékcella alá helyezve, majd az ellipszometriai spektrumukat megmérve az a.) ábrán látható görbékhez jutunk. b.) A hullámhossz tartományt a nm-es intervallumra korlátozva, a spektrumok kitűnő en illeszthető k. Azonban átlátszó hordozók esetén a kiértékelés koránt sem ennyire zökkenőmentes. Feltöltött folyadékcella mellett mért spektrumok az előzőesetre alkalmazott modellel nem illeszthetőek. Ennek oka, hogy levegőhelyett PBS oldat határolja a minta felületét, tehát a minta felszín és a környezet törésmutatójának különbsége több mint három tizeddel csökken. Bár optikailag a két közeg továbbra is elkülöníthetőlenne egymástól, a program beépített funkciójával a hátés előoldali reflexiók nem választhatók szét. Kétfajta módszer kínálkozik e probléma megoldására. Az első, mikor a hátoldali reflexió detektorba való bejutását szüntetjük meg: a hordozóra alulról félvégtelennek tekinthetőközeget illesztünk vagy megnöveljük a hordozó vastagságát annyira, hogy a hátoldali reflexió pusztán geometriai okokból ne juthasson a detektorba. Ez utóbbi kivitelezhetőpéldául úgy, ha egy vastagabb üveglemezt UV-ra keményedő törésmutató illesztő folyadékkal a hátoldalra illesztünk. Az így mért spektrumokra való (fentiekben bevezetett) Cauchy - Cauchy modell illesztés sikerét a a. ábra mutatja. (Megjegyzendő, hogy természetesen itt is figyelembe kell vennünk a kiértékeléskor, hogy a környezet PBS oldat.) A második módszer, mikor a kiértékeléskor próbáljuk orvosolni a fenti problémát. Erre egy lehetőség, mikor a modellt úgy módosítjuk, hogy a filmet leíró Cauchy függvényt egy megfelelően rugalmas függvényre, például ún. B-Spline függvényre [69] cseréljük. Ez esetben az illesztés a nm-es tartományban kiváló MSE érték mellett megtehető. ( b. ábra) További, a hullámvezető filmre épülő rétegek paraméterei a modellben új 42

43 a.) b.) ábra: Az átlátszó hordozó hátoldaláról visszaverő dőfény kiértékelést nehezítő hatása kiiktatható, ha a.) a hordozó hátoldalára eg y vastagabb üveglapot rögzítünk majd az így mért spektrumot Cauchy - Cauchy modellel illesztjük, illetve, b.) ha B-Spline függvényt alkalmazunk a Ta 2O5-ot modellezőcauchy függvény helyett. rétegek figyelembevételével bár nem bizonyítottan megbízhatóak, azonban becslésnek mindenképp megfelelőek. E módszerrel lehető ség nyílik átlátszó hordozók esetén is arra, hogy az optikai modellt továbbfejlesztve az ellipszometriai spektrumban rejlőinformációt integrálva, származtatott mennyiség(ek) változásaként adjuk meg (pl. fehérje réteg vastagsága, törésmutatója, felületi tömegsűrűsége). Ennek gyakorlati jelentőségét a 9. Rácscsatolt interferométer - spektroszkópiai ellipszométer kombinált összeállítás című fejezetben láthatjuk majd In situ kísérletek Ahogy azt már a fentiekben említettem, a Woollam M2000DI ellipszométer nagy mintavételezési sebességének köszönhetően, folyadékcellát alkalmazva lehetőségünk van akár a flagelláris filamentum szálak felületre való leválasztásának in situ és valós idejűnyomon követésére is. Feladatom volt, hogy a mért spektrumok kiértékeléséhez optikai modelleket fejlesszek. Terjedelmi okok miatt azonban a fejlesztés menetét nem részletezem, csupán a legígéretesebb optikai modellt mutatom be a fenti hordozókra leválasztott filamentumok rendszerére. A fentiekben használt {Si - SiO2 - Ta2O5} szeletekből kiválasztottunk két mintát, majd közülük az egyik felületét a Mintakészítés című alfejezetében leírtaknak megfelelően aktiváltuk. Ezt követően a mintákat rendre folyadékcella alá helyeztem. Állandó pumpafordulat mellett pár percig PBS oldattal öblítettem át a cellát, majd 0,1 mg/ml 43

44 koncentrációjú flagelláris filamentum - PBS oldatra váltva megkezdtem a fehérjék felületre való leválasztását. Hozzávetőlegesen 105 perc elteltével a cellát újra tiszta PBS oldattal öblítettem át. A mért spektrumok kiértékelését az előzőalfejezetben tárgyalt eredményekre építettem. A fehérjeréteget leíró modell megalkotásakor előzetes tapasztalataimat használtam fel. Sopra ES4G készülékkel követett kísérleteink kiértékelésekor megmutattuk, hogy a leválasztott fehérjeréteg oldatban a környezet és a fehérje paramétereinek megfelelő Cauchy függvényeket kombináló effektív közeg közelítést alkalmazó modellel (ang. effective medium approximation - EMA, ld.: Fontosabb ellipszometriai rétegmodellek ) alacsony MSE értékek mellett illeszthetők. Megmutattuk azt is, hogy két EMA rétegmodell egymásra helyezésével kvalitatív becslést tehetünk a flagellin szálak oldatbeli felületi struktúrájára [70]. Az alsó EMA réteg (EMA1) ugyanis egy tömörebb és vékonyabb réteget, míg a felső(ema2) egy vastagabb és fehérjében ritkább közeget fedett fel. ( ábra) E kísérleteket azonban nem tudtuk valós idejűmérésekkel nyomon követni, valamint a két EMA réteg nem adott megfelelőfelbontást a struktúrát illetőmélyebb következtetések levonására ábra: A felületre leválasztott flagelláris filamentumok feltételezett oldatbeli struktúrája [70]. Az új Woollam ellipszométer jobb teljesítőképessége (érzékenység, sebesség) következtében lehetőségünk van arra, hogy számos egymásra helyezett EMA modellt csatolt vastagságparaméterek mellett illesztve a spektrumokra ( a. ábra), rétegrő l-rétegre, in situ és valós időben meghatározzuk az ott érvényes tömegsűrűséget. Ehhez azonban (csak úgy, mint az előbbiekben is) fontos a fehérje törésmutatóját egy becsült értéken rögzítenünk, mivel e paraméter és az EMA modellben kombinált anyagok arányszáma erősen korrelál egymással. Ennek oka egyszerű: egy réteg effektív törésmutatója azonos értékre vezet, 44

45 ábra a.) A baloldalt látható rétegszerkezet minő sítésére javasolt optikai modell, melyben a felületre leválasztott FF réteget számos EMA alréteg írja le, jobboldalt látható. Ahogy azt a b.) ábra mutatja, az EMA alrétegek számának növelésével javul az illesztés jósága (MSE csökken), illetve a fehérjeréteg számított vastagsága konvergálni látszik. amennyiben kisebb törésmutatójú közeget nagyobb mennyiségben vagy nagyobb törésmutatójút kisebb mennyiségben keverünk az EMA második komponenséhez. A fehérje törésmutatóját az irodalomban javasolt értéknek megfelelően 1,45-nek választottam meg [71]. Mindenek előtt azonban fontos megvizsgálnunk, hogy a a. ábrán bemutatott optikai modell legfelsőrétegét hány EMA alrétegre érdemes felosztanunk. Ennek érdekében növelve az alrétegek számát a modell független térfogatszázalékait és a (csatolt) vastagság paramétert rendre a mért spektrumokra illesztettem. Az EMA alrétegek számának függvényében ábrázolva a kapott MSE-, illetve fehérjeréteg-vastagság értékeket ( b. ábra) láthatjuk, hogy az illesztés jósága javul az alrétegek számának növelésével. Ebből arra következtethetünk, hogy a fehérjeréteg végtelenül finom felosztása lenne egy ideális számítás alapja. Az alrétegek számával azonban csökken a rendszer stabilitása, azaz a paraméterek (kiértékelőprogram által számított) bizonytalansága nő. (Hat alréteg alkalmazásakor ez az érték már elfogadhatatlanul nagy.) E két ellentétes hatás optimumát öt alréteg alkalmazása esetén találtam meg. Mivel a számított fehérjeréteg-vastagság négy-öt alréteg esetén konvergálni látszik, feltételezhető, hogy ennyi már helyesen írja le a rendszerünket. A további kiértékelések során öt EMA alréteget alkalmaztam. A fenti elemzés után az alrétegek csatolt vastagságát érdemes rögzítenünk annak érdekében, hogy a szabad paraméterek számát, vele az eredményül kapott értékek bizonytalanságát tovább csökkentsük. A paraméterérték meghatározásakor azonban körültekintőnek kell 45

46 ábra Az öt EMA alréteges optikai modellel való illesztés eredményét láthatjuk az a.) ábrán. A FF leválasztás elő tt mért spektrumot jelek, míg az utána mért görbét szimbólumok jelölik ki. (Az ábrázolás áttekinthető ségének kedvéért csupán minden 5. mért adatpontot tüntettem fel.) A betétkép 632,8 nm -es hullámhosszon mért Δérték változását mutatja a leválasztás idejének függvényében. Az illesztésbő l származtatott paraméterértékekbő l kalkulált tömegsűrűség értékek változását a megjelölt alrétegekben a b.) ábra szemlélteti az időfüggvényében. Látható, hogy a felület közeli rétegekben (1, 2) az anyagmennyiség értéke jóval nagyobb, mint onnan távolodva (3, 4). lennünk. Annak érdekében, hogy biztosak lehessünk abban, hogy a rendszert helyesen modellezzük, válasszuk meg ezt az értéket úgy, hogy a leválasztás során a legfelsőalrétegben (és csakis itt) mindvégig zérus fehérje térfogatszázalékot mérjünk. Ez az ellenőrzőalréteg biztosítéka annak, hogy a modell a fehérjeréteget minden időpillanatban, teljes vastagságában figyelembe veszi. Ennek megfelelően a csatolt vastagságparaméterek értékét 190 nm-nek választottam meg. A a. ábrán bemutatott, az előzőbekezdésekben vizsgált optikai modell tipikusan 8 alatti MSE érték és 0,06 % alatti paraméter-bizonytalanság mellett értékeli ki a fentiekben bemutatott rendszeren mért ellipszometriai spektrumokat. Az illesztés minőségét a a. ábra szemlélteti. Láthatjuk, hogy mind a leválasztást megelőzően, mind azt követően a modell kiválóan illeszkedik a mérés eredményeire. A mérés érzékenységéről elmondható, hogy a leválasztás során ellipszometriai szög 632,8 nm-es hullámhosszon 20 -ot változott ( a. ábra betétképe), mely érték két nagyságrenddel nagyobb, mint a mérés azonos hullámhosszon számított zaja ( 0.1 ). De Feijter eredményei alapján a felületre leválasztott fehérjék Γ tömegsűrűsége a következőképpen számítható: [67] 46

47 d n n k dn / dc, (6.2.1.) ahol d a vizsgált réteg vastagsága, n az effektív törésmutatója, nk a környezet törésmutatója, dn/dc pedig a fehérjeoldat törésmutatójának koncentrációra vett gradiense. Ez utóbbi értéke az irodalomból ismert, 0,18 cm3/g (a He-Ne lézer hullámhosszán, azaz 632,8 nm-en mérve) [67]. A tömegsűrűség időbeli változását a hordozó felületéhez közelebb eső, elsőnégy EMA alréteg esetére a b. ábrán követhetjük nyomon. Az ötödik alrétegben mért tömegsűrűség a mérés bizonytalanságán belül (6 x 10-3 μg/cm3) zérusnak mutatkozott. A könnyebb átláthatóság érdekében ez nem került ábrázolásra. Érdemes a fenti kiértékelést nem aktivált felületen is elvégezni. Ekkor az alrétegekben mérhetőtömegsűrűség értékeket összegezve összehasonlíthatjuk a flagelláris filamentumok különbözőmódon előkezelt felületekhez történőkötődésének kinetikáját. ( a. ábra) Látható, hogy az aktivált felület esetén mind a leválasztás sebessége, mind a leválasztott anyag mennyisége jelentős mértékben eltér a nem aktivált felület esetén mérhetőértékektől, mely igazolja, hogy a felületkémiának jelentős szerepe van a flagelláris filamentum alapú érzékelőchipek gyártásában. Ezt a megfigyelést az azonos mintákról készített AFM képek is megerősítették, mivel a felületi fedettség a fentiekkel összecsengőmódon különbözik a két esetben. ( b. ábra) ábra a.) A fentiekben bemutatott modellel számolt össztömegsűrű ség aktivált és nem aktivált felületűminták esetére. b.) Az azonos mintákról készített 1 μm x 1 μm-os eredeti AFM felvételek aktivált s nem aktivált esetekre (felsőkét ábra), illetve ezek Gwyddion v.2.14 programmal feldolgozott, fedettséget jobban szemléltetőváltozatai (alsó két ábra). 47

48 A fehérjeréteg szerkezetanalízise egy lehetséges megoldás A b. ábrán bemutatott, a hordozó felületére merőleges (normális) irányú tömegsűrűség inhomogenitás összeegyezethető a ábrán bemutatott flagelláris filamentumok oldatbeli struktúrájára adott kvalitatív becsléssel, miszerint a felülethez rögzített filamentáris fehérjék orientációjuk szerint valószínűleg két csoportba sorolhatók: az elsőben ezek jó közelítéssel álló helyzetben, míg a másodikban többnyire a fekvőpozícióhoz közeliben találhatók. Érdemes alaposabban megvizsgálnunk, hogy ez a feltételezés valóban magyarázat lehet-e a tömegsűrűség sajátos mélységfüggésére. Ahhoz azonban, hogy az egyes alrétegekben mért tömegsűrűség értékekből a fehérjeréteg felületi struktúráját jellemzőparaméterekhez (fehérjeszálak jellemzőhossza, dőlésszöge, e paraméterek átlag körüli szórása) számadatokat rendeljünk, meg kell találnunk a kapcsolatot e mennyiségek között. Amennyiben sikerülne egy ilyen algoritmust megalkotnunk, nem csupán kvalitatív, hanem kvantitatív becsléseket is tehetnénk a réteget alkotó fehérjeszálak statisztikus elrendeződésére. A fentiekben kijelölt úton elindulva indokolt a b. ábrán látható görbék két szaggatott vonallal határolt szakaszára exponenciális függvényt illesztenünk, hogy a további számításokból ily módon kiiktassuk a mérést terhelőzajt. (Az illesztés jóságát, R2-et tipikusan 0,999 felettinek találtam.) További egyszerűsítésként, az illesztett exponenciális görbék amplitúdóját érdemes a legnagyobb értékkel, azaz az 1. alréteg amplitúdójával normálni, továbbá az ötödik réteg tömegsűrűség értékeit az előző alfejezet alapján minden időpillanatban egzaktul zérusnak tekinteni. Figyelembe kell vennünk, hogy minden időpillanatban csupán öt független adatpont áll a rendelkezésünkre, következésképpen hatékonyan csak a legegyszerűbb matematikai modelleket alkalmazhatjuk a felületet borító fehérjeréteg statisztikus jellemzésére. Az olyan modellek degenerációja ugyanis szükségszerű, melyek több független paraméterrel rendelkeznek, mint ahány független értéket a mérésünkben meg tudunk határozni. Ahhoz tehát, hogy a hiányzó információt pótoljuk, feltételezésekkel kell élnünk. A vizsgált rendszerünk esetén indokolt a következő közelítésből kiindulnunk: merev, rúd alakú flagelláris filamentumok hosszeloszlása monodiszperz Gaussos jelleget követ. E feltételezés alapja, hogy a flagelláris filamentumok protofilamentáris szerkezetükből adódóan valóban merev, csupán enyhén íves, hosszúkás szerkezetek [70], melyek élőpolimerizációs folyamat [72] során keletkeznek. 48

49 Még a fenti közelítéssel élve is számos, a komplexitás széles skálájáról válogatott matematikai modellt építhetünk fel. Ezek közül az egyik legkevésbé összetett az, mely még azt is felteszi, hogy a flagelláris filamentumok a felületre merőlegesen (a z tengellyel párhuzamosan) kötnek ki a hordozóra. Ahhoz, hogy e modell paramétereihez értékeket rendeljünk, Broyden-Fletcher-Goldfarb-Shanno (BFGS) optimalizációs módszerrel [73, 74, 75, 76, 77] illesszük a következőelméleti függvényt minden időpillanatban minden i-edik alrétegben (i = 1 5) a mért és normált tömegsűrűség értékre (az ehhez szükséges számítógépes algoritmust testvérem, Kozma Dániel fejlesztette ki): 1 norm (i, l,, d, c ) c 2 (i 1 )d 2 id ( z l ) e z dz dz, (6.2.2.) ahol l a flagelláris filamentumok hosszának várható értéke, σennek szórása, illetve c arányossági tényezőillesztési paraméterek, d az alrétegek vastagsága. A (6.2.2.) egyenlet meghatározza a tömegsűrűséget egy infinitezimális vastagságú rétegben (belsőintegrál), majd ebből számítja ki az i-edik alrétegre érvényes értéket (külső integrál). A numerikus gyökkeresést végrehajtva nem találtunk fizikai megoldást (negatív l értékeket kapunk vissza). Abban az esetben azonban, ha a (6.2.2.) egyenlet önmagával vett lineárkombinációját vesszük úgy, hogy a tagokat r1 és r2 értékekkel súlyozzuk (ahol r2=1-r1), a kiváló illeszkedés mellet (az illesztés hibája sok nagyságrenddel a spektrumkiértékelés hibája alatt van) fizikailag értelmezhetőeredményekre jutunk. Az illesztett egyenlet normálva az 1. alrétegre érvényes paraméterezéssel a következőalakban írható: r1 (i, l1, 1, d ) (1 r1 ) (i, l 2, 2, d ) norm (i, l1, 1, l 2, 2, d, r1 ), r1 (i 1, l1, 1, d ) (1 r1 ) (i 1, l 2, 2, d ) (6.2.3.) ahol az illesztendőparaméterek a következők: l1, σ1, l2, σ fejlődését a 2, és r 1, melyek idő a. ábra mutatja be. Fontos észrevennünk, hogy a normálás során c paraméterrel egyszerűsítettünk, így a (6.2.3.) egyenletben szereplőismeretlenek száma megegyezik az alrétegek, azaz az ismert paraméterek számával. Mindeközben nem szabad megfeledkeznünk arról, hogy a vizsgált rendszert illetően a fentiekben feltételezéseket tettünk, következésképpen 49 a modellparaméterek kiváló

50 ábra Feltételezve, hogy a flagelláris filamentumok hosszeloszlása monodiszperz Gaussos, a mélységbeli tömegsű rű ség eloszlásból következtethetünk a fehérjeréteg statisztikus háromdimenziós struktúrájára. A modell l1, σ 1, l 2 és σ 2 paramétereinek idő fejlő dését az a.) ábrán láthatjuk. Amennyiben feltesszük, hogy az 1. csoport filamentumai fő ként a hordozóra merő leges helyzetben vannak, a 2. csoport flagelláris filamentumainak tipikus dő lésszöge (α) az időfüggvényében a b.) ábrán tekinthetőmeg. A két csoport modellbeli súlyfaktorainak aránya (r2 /r1), illetve a dő lésszög figyelembevételével korrigált valódi számarány (p 2/p1) idő beli változása rendre a c.) és d.) ábrákon követhetőnyomon. illeszkedése mellett is a levont következtetések csupán becslésnek tekinthetők. Amennyiben azonban a kezdeti feltételezések jól közelítik a valóságot, helyes és fontos következtetéseket vonhatunk le a vizsgált rendszer szerkezetét illetően. Ebből kiindulva a modell elsőés nagyon fontos eredménye, hogy matematikai úton is sikerült alátámasztanunk azt a feltételezést, miszerint az immobilizált filamentumok két karakterisztikus csoportba oszthatók. Az a csoport, melyet kisebb szórás és nagyobb várható érték jellemez (1. csoport, l1, σ1) vélelmezhető, hogy a feltételezett orientációban (a felületre merőlegesen) köt a hordozóhoz. Mivel azonban monodiszperz rendszert feltételeztünk, nem magyarázható a 2. csoportra jellemzőnagyobb szórás (σ2) és jelentősen kisebb várható érték (l2) egyszerűen azzal, hogy 50

51 ezt rövidebb fehérjék alkotják. Az eltérésre az alapfeltevéssel konzekvens módon csupán az adhat magyarázatot, hogy ezek a szálak döntött helyzetben, a felülettel αszöget bezárva helyezkednek el a hordozón. Egyszerűelemi trigonometriai megfontolások alapján az átlagos dőlésszög becsülhető ( sin( ) l2 / l 1 ). ( b. ábra) A két csoporthoz tartozó szórásértékek jelentős különbségéből csupán arra következtethetünk, hogy a 2. csoport filamentumainak αszög szerinti szórása jelentősen nagyobb, mint az 1. csoporté. Ennél precízebb állítást nem tehetünk, hiszen a hosszeloszlás és a szögeloszlás nem választható ketté a fenti számítások alapján. A súlyfaktorok hányadosának ( r2 / r1 ) változását követve kiderül az is, hogy a két csoport aránya csupán enyhén függ az időtől. ( c. ábra) Mivel a flagelláris filamentumok hordozóval párhuzamos keresztmetszete nagyobb abban az esetben, ha ezek döntött helyzetben állnak, nagyobb súllyal szerepelnek a fenti kiértékelésben. Ahhoz hogy meghatározhassuk a két csoport valódi populáció arányát, r2 értékét (szintén elemi trigonometriai megfontolások alapján) le kell osztanunk d / cos( ) -val. Ezt figyelembe véve kapjuk, hogy a két csoport flagelláris filamentumainak valódi számaránya ( p 2 / p1 ) hozzávetőlegesen 1:1. ( d. ábra) A fenti illesztési paraméterekből természetesen kiszámítható a folytonos mélységbeli sűrűségprofil, melyet kiegészítve a fentiekben részletezett következtetésekkel lehetővé teszi, hogy a mérés bármely időpillanatában becslést adhassunk a felületi réteg háromdimenziós statisztikus szerkezetére is. A kísérlet 100. percében meghatározott sűrűségprofilt, s a belőle rekonstruált háromdimenziós struktúrát a ábra mutatja be. Jól látható, amint a ábra A modell által számított folytonos, normált mélységbeli tömegsű rű ség profil (baloldal), illetve az ennek alapján becsült háromdimenziós felületi struktúra (jobboldal). Az ábra a mérés 100. percében érvényes paraméterértékek figyelembevételével készült. (l1 =620,9 nm, σ1=32,4 nm, l2 = 175,5 nm, σ 2=92,1 nm and p2/p1=1:1,02) 51

52 fehérjeszálak két csoportra különülnek el; egy fekvőpozícióhoz közeli, s egy jellemzően álló filamentumokat tartalmazóra. Ezek az eredmények jól összecsengnek az előzetes SE és OWLS mérésekből levonható következtetésekkel [70, 78]. Annak érdekében, hogy a rétegépülést időben is vizsgáljuk, térjünk vissza a ábrához. Ahogy azt a a. és d. ábra mutatja, egy rövid kezdeti tranziens után a statisztikus paraméterek már csak lassan változnak: p2/p1 nő, míg l 1, σ1, l2, σ2 és αcsökkennek. Egy lehetséges magyarázat lehet a következő: a leválasztás során az 1. csoport flagelláris filamentumainak kis hányada elfekszik, ezalatt vagy emiatt a 2. csoport elemei egyre jobban közelítik a fekvőhelyzetet ( c. ábra), mely következtében egyre tömörebb és egyre kisebb σértékkel jellemezhető felületközeli régió jön létre. Pontosabb következtetések levonásához azonban további kísérletek szükségesek. Fontos megjegyezni, hogy pontosan azok a ritka, előnyös tulajdonságok, melyek kitűntetik az ellipszometriát a többi eljárással szemben, nehezítik meg a fenti eredmények más mérési módszerekével való összehasonlítását. Az a műszer ugyanis, mely hasonlóan fontos eredményekre képes mutatni a bemutatott rendszert illetően, a fehérje-leválasztást bizonyára nem csupán in situ tudja nyomon követni, hanem a formálódó rétegről mélységbeli információt is képes szolgáltatni. Bár az előbbi viszonylag könnyen megoldható más eljárások alkalmazásával is, az utóbbi rendszerint nehézségekbe ütközik; kvarc kristály mikromérleg, illetve pásztázó módszerek (pl.: AFM, STM, stb.) alkalmazásával csak körülményesen, vagy egyáltalán nem oldható meg ez a feladat, az evaneszcens módszerek (OWLS, DPI, SPR, stb.) eltekintve bizonyos speciális hullámvezető elrendezésektől [57, 60] csupán hozzávetőlegesen nm behatolási mélységgel, általában egyetlen hullámhosszon képesek vizsgálni a felületi vékonyréteget. Amennyiben pedig a mintánkat ex situ módszerekkel vizsgáljuk (pl.: AFM, STM, XRD, SEM, stb.) felmerül a kérdés, hogy vajon mi a kapcsolat az ex situ és in situ paraméterek között. Németh Andrea trükkös ötlete alapján megkíséreltük a flagelláris filamentumok hosszeloszlását AFM mérésekkel is meghatározni. Az ötlet lényege, hogy amennyiben a leválasztást csupán rövid ideig futtatjuk viszonylag kevés fehérje, egymástól távol köt ki a felületre. Az ilyen mintákról készített AFM képek ( ábra) noha nem problémamentesen, de kiértékelhetők a megfelelőképfeldolgozó eljárásokkal. Ennek eredménye jelentősen rövidebb várható értékkel és lényegesen nagyobb szórással jellemezhetőhosszeloszlásra mutatott (lafm 400 nm és σafm 210 nm), mint ahogy azt az ellipszometriai mérések alapján várnánk (lse 620 nm és σse 30 nm). Bár a szignifikáns eltérést számos ok indokolhatja, nem szabad megfeledkeznünk a következőeredményt 52

53 befolyásoló tényezőkről sem: az AFM méréseket megelőzően a mintákat ultratiszta vízzel öblítettük le, hogy a PBS oldat sójától (mely később a felületen kristályosodna ki) megszabadítsuk a felszínt, majd nitrogén gáz áramában szárazra fújtuk azt. E kezelés azonban a felületre kötött flagelláris filamentumok töredezésével, depolimerizációjával illetve részleges (esetleg méret függő) lemosódásával jár. Ezen kívül, az egymással átfedő filamentumok nehezítik, pontatlanná teszik a képfeldolgozást. Következésképpen a két mérés disszonanciája nem cáfolhatja az ellipszometriai eredményeket. Ehelyett világosság teszi, hogy milyen fontosak is az in situ és roncsolásmentes módszerek a nanobiológia területén ábra Rövid FF leválasztási idő t követő en az ultratiszta vízzel öblített, nitrogén gáz áramában szárított mintáról készült AFM kép. A fehérjék orientációja a lemosási és szárítási fázisok következménye. Az AFM kép mérete: 10 μ m x 10 μm Összefoglalás és kitekintés Jelen fejezet legjelentősebb eredménye, hogy rámutatott, a felületre leválasztott flagelláris filamentumokat nem csupán egyetlen rétegként tudjuk ex situ vizsgálni, hanem akár in situ és valós időben, felbontva azt számos rögzített vastagságú alrétegre követhetjük nyomon a rétegépülést. Ennek alapján nem csupán kinetikai vizsgálatokat végezhetünk, hanem a felülethez rögzített hosszú flagelláris filamentumok oldatbeli struktúráját is még mélyrehatóbban kutathatjuk. Mindennek jelentősége abban áll, hogy az új ismeretek birtokában az érzékelőfelületek tervezésekor az oldatáram számára elérhetőcélmolekula kötőhelyek számát meghatározhatjuk és tervezhetjük, mellyel segíthetjük a még célorientáltabb felismerőrétegek gyártását. Végül fontos megjegyezni, hogy olyan eljárás, mely képes azonos vagy hasonló rendszer mélységbeli sűrűségprofilját meghatározni, legjobb tudomásom szerint a szakirodalomban mindmáig nem ismert. 53

54 Már majdnem elkészült Német Andrea kézirata is, melyben a molekula dinamika jellegű módszerre építő MATLAB algoritmusával kapott első eredményeit foglalja össze. Szimulációi a fentiektől függetlenül alátámasztani látszanak azt a ábrán bemutatott eredményt, mely szerint a felületközeli régiókban található, fekvőhelyzetű flagelláris filamentumok közül függőleges közeli orientációval jellemezhetőek emelkednek ki. Eredményeit várhatóan pár hónapon belül publikálja. 54

55 7. Rácscsatolt interferométer - refraktometria Jelen fejezet egy jelölésmentes, optikai érzékelésre alkalmas ún. rácscsatolt interferométer jelátalakító prototípus megvalósításáról, illetve a vele végzett elsőrefraktometriai mérések eredményeiről számol be. Részletezi továbbá a műszerelrendezés felépítését, valamint a jelátalakító válaszjelének előállítására, rögzítésére és kiértékelésére hivatott mérőés vezérlő elektronikák és számítógépes algoritmusok működésének elvét is. A rácscsatolt interferométerrel végzett első, működést igazoló refraktometriai kísérletek bizonyítják, hogy a jelátalakító már e jelen fejezetben bemutatott kezdetleges állapotában is ~10-5-es érzékenységgel képes a törésmutató változásának nyomon követésére. Ahogy az az Jelölésmentes érzékelő k jelátalakítói címűfejezetben bemutatásra került, a jelölésmentes optikai jelátalakítók számos tekintetben jobb alternatívát nyújtanak célmolekula - felismerőelem típusú folyamatok nyomon követésére és vizsgálatára, mint az egyéb, más elven működőtársaik. Láthattuk, hogy napjaink legsikeresebb és legelterjedtebb optikai jelátalakító eszközei főként a hullámvezetés és/vagy az interferometria rendkívüli érzékenységét kihasználva látják el feladatukat. A jelölésmentes integrált optikai érzékelők elsőbemutatkozása óta, a hozzájuk kapcsolódó tudományterület intenzív kutatás és fejlesztés alatt áll. Mára már alkalmazási területük igen széleskörű; a gáz és páratartalom érzékelőktől, a refraktométereken át, a valós időben követett célmolekula - felismerőelem típusú kísérletekig terjed [9, 10, 11, 17]. Bár számos ilyen elven működő, kiváló érzékenységgel bíró vizsgálati módszerről olvashatunk a szakirodalomban, az igény egy kis költségvonzatú, felhasználóbarát eljárásra továbbra is kielégítetlen maradt. Ennek okai lehetnek, hogy az ilyen típusú érzékelők nagy értékűalkatrészekből épülnek fel, nehezen beállíthatóak, vagy nem biztosítanak lehetőséget a párhuzamos mérésekre. Ezen kívül jellemzőrájuk, hogy, mivel mozgó alkatrészeket tartalmaznak nehezen építhetők össze más mérési eljárásokkal, nem miniatürizálhatók, így nem illeszthetők például a napjainkban egyre inkább előtérbe kerülőlab-on-a-chip alkalmazásokhoz. Előfordul, hogy rendkívül zajérzékenyek, így fejlesztőik hatalmas energiát kell, hogy fordítsanak a környezet kellemetlen hatásaitól való elszigetelésükre. Ez azonban gátja a kézi-műszer kivitelnek is. A spektroszkópiai ellipszométerek előnye, hogy nem szükséges érintéses kapcsolat a jelátalakító és a felismerőelemet hordozó egység között, továbbá, hogy a minta felülete időben párhuzamosan vagy sorosan gyakorlatilag tetszőleges pontokban könnyedén 55

56 mérhető. Hátrányai azonban, hogy forgó-mozgó, robosztus alkatrészeik miatt, miniatürizálhatóságuk nem megoldott. Az esetükben használt folyadékcellák térfogata is nagy, néhány milliliter. Továbbá, mivel a vizsgáló fény áthalad a folyadékfázison, erősen szóró vagy elnyelőoldatok esetén nem alkalmazhatók [53]. Esetenként hátrányt, máskor pedig előnyt jelenthet, hogy e műszerek érzékenysége nem koncentrálódik az érzékelő felületére. Bár az optikai Mach-Zender interferométerek könnyen integrálhatók párhuzamos mérésekre alkalmas eszközökbe, az érzékenységük a mérő- és referenciaág aktuális fáziskülönbségének függvénye. A működésüket leíró ( ) interferencia egyenlet deriváltja szerint ugyanis a fáziskülönbség szinusza határozza meg a szenzorfelületen történőegységnyi változásra adott válasz mértékét. Így az interferencia egyenlet szélsőértékei közelében az ilyen elven működő eszközök érzékenysége elvész. További hátrányuk, hogy abszolút intenzitást mérnek, így a maximális erősítés és kioltás intenzitásértékeire kalibrálnunk kell e készülékeket. Az optikai hullámvezetőfénymódus spektroszkópok rácscsatolóik révén stabil és abszolút mérést tesznek lehetővé. Hátrányuk azonban, hogy a működésükhöz elengedhetetlen precíziós goniométer asztal jelentősen megemeli az ilyen eszközök árát, továbbá e mozgó alkatrész nem csupán megnehezíti a más eszközökkel való összeépítést, de méretük csökkentésének is gátat szab. A sík dielektromos hullámvezetőalapú módszerek nagy előnye az SPR spektroszkópokkal szemben az, hogy a jelátalakítójuk tervezésekor jóval nagyobb szabadsággal rendelkezünk. Bár mindkét eljárásban az evaneszcens sugár behatolási mélységét a hullámvezetőoptogeometriai paraméterei határozzák meg, az SPR spektroszkópok alkalmazásaiban ez az érték egy erősen korlátok közé szorított szám (hozzávetőlegesen 200 nm) [57]. A hullámvezetők esetében ez a paraméter sokkal tágabb határok között mozoghat. A szenzor opto-geometriai paramétereinek alkalmas megválasztásával az evaneszcens mezőakár ~ μm mélyen is beleláthat a vizsgált térfogatba [57]. Az ilyen jellegűrugalmasság előnyt jelenthet például nagyobb méretűbiológiai elemek baktériumok, sejtek vizsgálatánál [17, 57, 60], vagy épp a több száz nanométer hosszú flagelláris filamentum felismerőelemekkel történődetektálás során. A hullámvezetők továbbá főként a rácscsatolók alkalmazása miatt könnyebben formálhatók tömbi működésre (párhuzamos mérésekre) képes jelátalakító elemekké [79]. E tulajdonság pedig a jól használható bioszenzorikai alkalmazások kulcsa. Jelen fejezetben egy olyan jelölésmentes optikai jelátalakító eszköz, ún. rácscsatolt interferométer [80] megépítéséről és teszteléséről számolok be, mely egyszerre érvényesíti a fenti eljárások összes előnyét úgy, hogy közben azok felsorolt hátrányaival nem rendelkezik. 56

57 Kizárólag alacsony költségigényűalkatrészekből épül fel. Nem tartalmaz forgó elemeket, így nagyobb nehézségek nélkül miniatürizálható és összeépíthető más műszerekkel is. A működését biztosító hullámvezetés és interferometria, valamint az alkalmazott folyadékkristály modulátor későbbiekben bemutatásra kerülő ötletes kombinációjának természetes következményeként, nagy mérési tartományon át kiváló és állandó érzékenységgel mérhetünk. A rácscsatolt interferométer érzékelő felülete a kísérletnek megfelelően tervezhetőoptikai paraméterekkel bíró sík dielektromos hullámvezető, mely film rétegébe rácscsatolók diffraktálják a polarizált és koherens fényt. Mindez nagyobb alkalmazási szabadságot és stabilitást kölcsönöz a szóban forgó eszköznek. Megfelelő rendszerben elhelyezett rácscsatolók alkalmazásával a későbbiekben párhuzamos mérésekre, lab-on-a-chip alkalmazásokra is nyílhat majd lehetőség Az elsőmérési összeállítás A rácscsatolt interferométer két főalkotóból, egy Mach-Zender interferométer jellegűszabad fényterjedésűnyalábosztóból és egy integrált optikai egységből felépülőeszköz, ún. hibrid Mach-Zender interferomer, mely a hullámvezetés rendkívüli felületérzékenységét erősíti tovább az interferometria nyújtotta fázisérzékenységgel. Az összeállítás működését a ábra szemlélteti ábra A Mach-Zender interferométer jellegűtükörrendszerbő l és integrált optikai egységbő l felépülőrácscsatolt interferométer működését illusztráló sematikus ábra. 57

58 A Mach-Zender interferométer jellegűtükörrendszer két féligáteresztőés két hagyományos tükör segítségével két párhuzamos és koherens nyalábra osztja a He-Ne lézer fényforrás fényét. A referencia ág (1. nyaláb, szürke vonal) fázisát egy erre alkalmas folyadék kristály modulátor (ang. liquid crystal modulator - LCM) segítségével, időben folyamatosan, folytonosan és periodikusan változtatjuk, majd az integrált optikai egység monomódusos, sík dielektromos hullámvezetőfilmrétegébe csatoljuk. A mérőág (2. nyaláb, fekete vonal) fénye modulálatlanul, az 1. nyaláb hullámvezető filmbe való becsatolási helyétől néhány milliméterrel arrébb érkezik a csatolórácsra. A vázolt geometria következtében a 2. nyaláb jelentős utat tesz meg az integrált optikai egységben mielőtt találkozna és interferálva egyesülne a referencia ágból érkezőpárjával. A becsatolási pontok közötti területet, az ún. érzékelőfelületet refraktormetriai és bioszenzorikai kísérletek esetén folyadékcellával fedjük le. ( ábra) A hullámvezetővégén kilépőinterferenciajelet egy erre alkalmas detektor, analóg-digitál jelátalakító és számítógép rendszerének segítségével rögzítjük ábra A rácscsatolt hullámvezetőintegrált optikai egységének érzékelőfelületére illesztett folyadékcella segítségével a rácscsatolt hullámvezető alkalmassá tehető refraktometriai és biológiai vizsgálatokra. A fentiekben ismertetett rácscsatolt interferometert Newport optikai asztalon építettem meg, melyet nitrogéngázzal feltöltött, Festo elemekkel nyomásszabályzott gumitömlőkre fektettem, hogy az alátámasztás felől érkezőrezgésektől elszigeteljem. Az alkalmazott 15mW-os Melles Griot He-Ne lézer fényforrás (25-LHP ) 632,8 nm hullámhosszú fényét a Tektronix (AFG3022) jelgenerátorral hajtott folyadékkristály modulátoron keresztül, TM polarizációban csatolom a Suprasil-1 kvarchordozóra leválasztott 200 nm vastag, monomódusos, Ta2O5 filmréteggel ellátott hullámvezetőbe. Az Ismatec perisztaltikus pumpával áramoltatott oldatok 58

59 ábra A megvalósult rácscsatolt interferométerrő l készült fotó. érzékelőfelületre történőjuttatását folyadékcella alkalmazásával oldottam meg. A műszer elemeinek rögzítését és pozícionálását Magyar Optikai Művek (MOM) és Thorlabs eszközökkel kiviteleztem. Az interferencia jelet Hamamatsu (S22B1-4K-H983) félvezető detektorral Keithley (427) erősítőn keresztül, az általam kifejlesztett C++ környezetben futó program vezérlésével Advantech (USB-4711, valamint USB-4716) analóg-digitál átalakítókkal rögzítettem, majd ezt egy szintén általam fejlesztett C++ illetve MATLAB programokkal elemeztem. A megépített műszert a ábrán láthatjuk Integrált optikai egység A következőmérésekben használt integrált optikai érzékelőegységek a Műszaki Fizikai és Anyagtudományi Kutatóintézet Dr. Hámori András nevéhez fűződő, szabadalmaztatott eljárásával készültek. A szabadalmaztatott felületmegmunkálási eljárás menete röviden a következő: A hordozó felületét vékony rezisztréteggel bevonják, majd ezt egy holografikus összeállításban, a kívánt rácsmintázatnak megfelelően megvilágítják. Az alulexponált területekről eltávolítják a felesleges rezisztet, majd az így kapott felületi struktúrán keresztül ion-implantálják a hordozót. Ennek következtében megszületik a törésmutató rács a hordozó felület közeli rétegében. Végül a hordozó felületét megtisztítják, majd elektronsugaras párologtatással hozzávetőlegesen 200 nm vastag Ta2O5 hullámvezetőréteget növesztenek rajta. Az így kapott integrált optikai egység egy jó hatásfokú, temetett rácscsatolóval ellátott monomódusos hullámvezető[81]. 59

60 7. 3. Folyadékkristály modulátor A rácscsatolt interferometerek interferométer klasszikus, LCM jelen egység fejezet nélküli működtetése bevezetőjében a Mach-Zender bemutatott hiányosságait eredményezné. A rácscsatolt interferométer egyik lényegi újítása az, hogy amennyiben a referencia ág fázisát 2π-nél nagyobb értékkel periodikusan és folytonosan moduláljuk, ennek megfelelő, szintén periodikusan változó, legkevesebb két szélsőértékkel (egy maximális erősítési és egy maximális gyengítési ponttal) rendelkezőinterferenciajelet kapunk. A szélsőértékek intenzitásértéke automatikusan kalibrálja rendszerünket, a folytonos moduláció pedig állandó maximális érzékenységet biztosít. A függvénygenerátorból érkezőlegfeljebb 10V amplitúdójú, néhány Hz frekvenciájú, periodikus négyszögjel hatására bekövetkező folytonosan változó LCM fázismoduláció, azonos frekvenciájú, szintén periodikusan és ábra: A folyadékkristály modulátor a jelgenerátorból érkezővezérlő jelre (felső grafikon) adott normált válaszjele (alsó grafikon). folytonosan változó interferencia jelet eredményez. A kapott válaszjel felbontható egy gyorsan és egy lassan változó szakaszra, melyek rendre megfeleltethetők a függelék Nematikus folyadékkristály modulátor címűfejezete alapján a folyadékkristály molekuláinak feszültség hatására történőorientálódásának, illetve, a gerjesztőfeszültség megszűnésével, relaxációjának. A gyors és lassú hullámok időben állandó, periodikus vezérlés esetén az LCM-re jellemző stabil, állandó karakterisztikával jellemezhető válaszjele, melyeket a [-1; 1] intervallumra normálva (továbbiakban: normálva) a ábra szemléltet. 60

61 Megjegyzendő, hogy a ábrán látható vezérlőjel egymást követőnégyszög alakú feszültségugrásainak váltakozó előjelét (alterálását) az indokolja, hogy előjelváltás nélküli esetben a szabad ion diffúzió következtében a modulátor károsodna, majd működése leállna. A fentiekben bemutatott mérési összeállításban alkalmazott modulátort kitöltőnematikus folyadékkristály-réteg vastagsága, d és az ne extraordinárius, no ordinárius törésmutatók különbsége, Δn a gyártó által meghatározott értékek (bővebben ld.: Nematikus folyadékkristály modulátor ). Méréseim alapján, az ilyen paraméterekkel jellemzett modulátorok gerjesztett egyensúlyi állapotból való relaxációja során a rajtuk áthaladó fény fázisának ½ πradián eltolásra képesek mikrométerenként. Számításba kellett vennem, hogy a válaszjel gyors és lassú szakaszainak legelejét, a görbék leggyorsabban változó részét az itt jelentkezőjeltorzító effektusok miatt célszerűfigyelmen kívül hagyni. Így annak érdekében, hogy legalább két szélsőérték biztosan megtalálható legyen a detektált válaszjel torzulásmentes szakaszaiban, jelen fejezetben tárgyalt kísérletekben hozzávetőlegesen 8 μm hasznos folyadékkristály-réteg vastagságot alkalmaztam A szenzorműködés elve Az előbbiekben ismertetett válaszjel szélsőértékeinek pozícióját két tényezőhatározza meg. Az első a rendszer beállításból adódó (ideális esetben) időben nem változó mennyiség a mérőés referencia ágak az integrált optikai egységbe való becsatolásukig megtett úthosszak különbségéből adódó r fázistag. A második, az L hosszú érzékelőfelület alatt terjedőmódus fázisának eltolódásából származó, egyedül a mérőág fázisához hozzáadódó komponens, melyet a függelék Hullámvezetés izotróp közegben címűfejezete alapján, N effektív törésmutató és k0 vákuumbeli hullámszám segítségével a következőalakban írhatunk fel: Nk 0 L. (7.4.1) E szakaszon, a terjedőmódus evaneszcens mezeje által letapogatott térrészben, a fedőréteg optikai paramétereinek és így a két sugármenet fáziskülönbségének megváltozása révén az interferencia válaszjel szélsőértékeinek helyzete arányosan eltolódik. Az érzékelőfelületre folyadékcellát helyezve, rajta a kívánt oldatokat áthajtva, a minimumok és maximumok helyzetének folyamatos követése egyszerű, elegáns és érzékeny módját adja a detektálásnak. Mivel az interferencia periodikus jelenség, a válaszjel minden 2πfázistolást követően önagába megy át. E tény következménye, hogy az érzékelési tartományt maga a válaszjel 61

62 semmilyen módon nem korlátozza. Ennek felsőhatárát egyedül a hullámvezetőfilmrétegének törésmutatója ( 2.1, ld. előző fejezet) szabja meg, hiszen a filmrétegénél magasabb törésmutatóval jellemezhetőfedőréteg esetén a hullámvezetés megszűnik. Jelen és az előzőalfejezetekből levonható, összefoglaló jellegűkövetkeztetés tehát az, hogy a fentiekben ismertetett rácscsatolt interferométerrel a vákuum (levegő) és a hullámvezetőfilm optikai tulajdonságai által korlátozott, refraktometriai és bioszenzorikai kísérletek szempontjából rendkívül széles mérési tartományon keresztül állandó érzékenységgel mérhetünk A mérés menete A rezgésmentes asztalon megépített rácscsatolt interferométer lézer fényforrásának fényét a Mach-Zender jellegűtükörrendszerbe irányítjuk. A két hagyományos és két féligáteresztő tükör finombeállító csavarjaival a mérőés referencia ágak nyalábjait a kilépőoldalon fedésbe hozzuk egymással úgy, hogy a fényútba helyezett ernyőn az LCM fázismodulációjának hatására interferenciacsík-mentes, vibráló foltot lássunk, majd az ernyőt eltávolítjuk. Ezt követően a modulációt szüneteltetve, a fénynyalábokat a csatolórácsra irányítva, a hullámvezető-folyadékcella rendszer befogójának óvatos forgatásával megkeressük a becsatolási szöghelyzetet. A mérőág kitakarásával a referencia ág sugarát a tükörrendszer megfelelőcsavarjaival párhuzamosan eltoljuk ügyelve arra, hogy a csatolás megmaradjon. A kívánt távolság beállítása után a mérőág kitakarását megszüntetjük, a modulációt újraindítjuk, majd a rácscsatolt interferométer minden beállító csavarját rendkívül óvatosan addig állítgatjuk, míg az elérhetőmaximális amplitúdójú válaszjelet nem detektáljuk. A detektort a hullámvezetővégéhez toljuk, lezárjuk a műszert takaró dobozt, az erősítőn kiválasztjuk a megfelelő erősítési értéket, hozzávetőlegesen 0 V-ra állítjuk a válaszjel egyenáramú komponensét, ellenőrizzük, hogy a szóban forgó jel az analóg-digitál átalakító mérési tartományán belül van-e, majd indítjuk a felvételt vezérlőprogramot. A felvételt vezérlő program C++ környezetben fut, mely működése röviden a következőképpen foglalható össze. A program az általa szabályzott analóg-digitál jelátalakító segítségével nem csupán az interferencia válaszjelet, hanem a LCM vezérlőjelét is rögzíti az időfüggvényében. Ez utóbbi alapján a lefutó és felfutó éleket követve a mért interferencia választ gyors és lassú jelekre szeparálja. (Megkülönböztetheti továbbá a lefutó és felfutó élek utáni relaxáció során megfigyelhetőválaszjeleket is.) Az ily módon szétválasztott adatsort külön oszlopokba rendezi, majd a periódus sorszámával jelölt ASCII fájlban eltárolja. 62

63 7. 6. Az első, működést igazoló kísérletek Az elsőkísérlet célja csupán a szenzoreffektus demonstrálása volt. Az érzékelőfelületre illesztett folyadékcellába először ultratiszta (Milli-Q) vizet áramoltattam, majd a fentiekben részletezett módon, 100 ks/s-os mintavételezési frekvencia mellett felvettem a válaszjelet. Ezt követően a folyadékcellát 0,25 %-os glicerin - ultratiszta víz keverékével öblítettem át. A válaszjelet ebben az esetben is rögzítettem. A lassú jelek intenzitás - időadatsorait Origin Pro 7.5 programmal ábrázoltam. ( ábra) A kapott görbék egyértelműen mutatják a A szenzorműködés elve címűalfejezetben tárgyalt jelenséget, miszerint az érzékelőfelület környezetében történőoptikai változások a válaszjel szélsőértékeinek eltolását eredményezik. A két oldat törésmutató különbsége 4,6 x 10-4, melyet a kereskedelemben kapható 5 tizedesjegyre pontos Rudolph Reflakométerrel határoztam meg ábra: A válaszjel eltolódása az érzékelőfelületre áramoltatott oldat 4.6 x es relatív törésmutató változásának következtében. A második refraktometriai alapkísérlet a rácscsatolt interferométer stabilitását és a mérés jelzaj viszonyát hivatott bemutatni illetve meghatározni. A folyadékcellát először ultratiszta vízzel, majd rendre 0,25 %-os, 0,5 %-os, 0,8 %-os glicerin - ultratiszta víz oldatokkal töltöttem fel. Minden oldatcserét követően a folyadékcellát ultratiszta vízzel öblítettem át. Ezen oldatok 4,6 x 10-4, 9,1 x 10-4, valamint 1,46 x 10-3-as ultratiszta vízhez viszonyított relatív törésmutató értékekkel jellemezhetőek. Minden egyes állapot stabilizálódott gyors és lassú válaszjelét számítógéppel, hozzávetőlegesen 4 Hz-es LCM vezérlés mellett, 50-szer rögzítettem, majd egy általam fejlesztett szélsőérték keresőc++ algoritmus segítségével meghatároztam minden eltárolt lassú válaszjel elsőintenzitás minimumának pozícióját. Ezt követően, az így kapott adatokat a mérés sorszámának függvényében ábrázoltam. ( ábra) 63

64 ábra: A mért válaszjelek első minimumának pozíciója a mérés sorszámának függvényében a cellán átfolyó ultratiszta víz 0,25 %-os, 0,5 %-os, majd 0,8 %-os glicerin ultratiszta víz oldatokra való cseréjének hatására. A felhasznált oldatok ultratiszta vízhez viszonyított relatív törésmutatóit is feltű nteti az ábra. Megjegyzendő, hogy a gyors válaszjelek főként azért nem képezik a kiértékelés részét, mert azok 10-szer rövidebb idejűlefutása következtében a hozzájuk tartozó görbék rosszabb felbontásúak, így pontatlanabb eredményekre vezetnek. Az ábrán bemutatott eredmények jól tükrözik a rácscsatolt interferometer kiváló stabilitását és reverzibilitását, ugyanis a cella ultratiszta vízzel történőátöblítése után a mért jel jó közelítéssel rendre kezdeti állapotába tért vissza. Jelen kísérlet alkalmas arra is, hogy a mért értékek segítségével meghatározzuk a rácscsatolt interferométer érzékenységét. A legkisebb még detektálható változást a szakirodalom a rendszer állandó bemenetre adott válaszának zajából számított szórás háromszorosával definiálja [82]. A mért platókon számított szórás értéke 16 μs, mely háromszorosát megszorozva a legnagyobb relatív törésmutató változás (1,46 x 10-3) és a hozzá tartozó intenzitás minimum pozíció ugrás (4,204 ms) hányadosával kapjuk, hogy a rendszer törésmutatóra átszámított érzékenysége 2 x Mely érték alapján kijelenthető, hogy a jelen fejezetben bemutatott rácscsatolt interferométer máris meghaladja (vagy eléri) számos kereskedelemben kapható, optikai jelátalakító teljesítőképességét. (vö.: I. táblázat) Kihasználhatjuk, hogy a rácscsatolt interferométer a több mint 2π-n keresztül tartó fázismodulációjának következtében automatikusan kalibrálja önmagát, így a detektált interferenciajel maximális erősítéséhez és kioltásához tartozó Imax és Imin intenzitásértékek minden ciklusban pontosan ismertek. A válaszjelek lecsengővégeinek stabilizálódott, hosszú szakaszain mért, számos mérési pontra átlagolt intenzitás (Istab ) és az előbbi értékek alapján a 64

65 válaszjelek fázisa a függelék Interferencia címűalfejezete alapján a következő, interferencia egyenletből származtatott összefüggés alapján meghatározható: I stab I max I min arccos I I. max min (7.6.1.) Amennyiben a ábrán bemutatott kísérleti eredmény első mérési pontjából meghatározott értékkel minden átszámított fázist eltolunk, a kezdeti állapothoz viszonyított, az érzékelőfelületen történőváltozások következtében kapott relatív fázistolást ( ) ábrázolhatjuk. ( a. ábra) Az egyes platókhoz tartozó átlagos fázisértékeket a hozzájuk tartozó ismert relatív törésmutatók függvényében ábrázolva igazolhatjuk, hogy a rendszer érzékelőfelületével kapcsolatban álló oldat optikai paramétereinek megváltozására a rácscsatolt interferométer lineáris választ ad: a kapott pontokra kiváló jósági tényezőmellett (R2 = ) illeszthetünk egyenest. ( b. ábra) Bár e rendkívül egyszerű és hatékonynak tűnőkiértékelési mód szemléletes eredménye kellemes befejezését adhatná e fejezetnek, azonban az eljárás szomorú hátránya, hogy újra bevezeti rendszerünkbe a MachZender interferométerek esetén tárgyalt intenzitás szélsőértékek közelében tapasztalható érzékenységvesztést (ld.: jelen fejezet bevezetése) ábra: a.) A glicerin - ultratiszta víz oldatsorozat hatására mérhetőrelatív fázistolás értékek b.) relatív törésmutatók függvényében ábrázolt pontjaira illesztett egyenes jól tükrözi a rácscsatolt interferométer linearitását. 65

66 7. 7. Összegzés A fejezetben ismertetett rácscsatolt interferométer működési elvét és létjogosultságát kísérletekkel igazoltam, megmutattam, hogy a műszer érzékenyen reagál az érzékelő felületének közvetlen környezetében végbemenő törésmutató változásra, illetve egy szisztematikus mérési sorozattal meghatároztam, hogy a jelátalakító már e kezdetleges állapotában is ~10-5-es érzékenységgel képes a törésmutató változásának nyomon követésére. A válaszjel fázisának meghatározásával igazoltam az érzékelés linearitását is. Azonban nem szabad szem elől tévesztenünk, hogy a jelátalakító eszköz még további fejlesztésre szorul: Szükséges egy olyan válaszjel kiértékelési módot találnom, mely az érzékelőfelületen lejátszódó optikai változást, a hullámvezető rétegben terjedő fény fázistolását érzékenységvesztés nélkül adja vissza eredményül, illetve, mely stabilitása és pontossága a műszer által elérhetőérzékenység alatt van. Fontos megvizsgálnom, hogy a vezérlőjel paraméterei optimalizálhatók-e, a mintavételezési frekvencia növelhető-e, továbbá, hogy integrálható-e a rendszerbe referencia egység, mellyel a rendszert terhelőzaj hatékonyan kiszűrhető. Mindezekre megoldást adva a fentiekben bemutatott eszközzel elérhetőmaximális érzékenység várhatóan legalább egy nagyságrenddel javítható lenne. A következő, 8. Rácscsatolt interferométer bioszenzorikai kísérletekhez címűfejezet e fenti kérdésekre kíván választ adni. 66

67 8. Rácscsatolt interferométer bioszenzorikai kísérletekhez A 7. Rácscsatolt interferométer - refraktometria címűfejezetben bemutatott műszert továbbfejlesztve biológiai kísérletekre is alkalmas eszközt kapunk. Amennyiben a jelátalakító válaszjelének fázisát egy hatékony és stabil modellfüggvény illesztésével határozzuk meg, illetve egy plánparalel üveglemezzel keltett interferencia referencia válaszjel egyidejű monitorozásával a műszer szabad fényterjedési egységéből eredőzajt kiszűrjük, az eszköz törésmutató érzékenysége < 10-6-ra javítható, mely megfeleltethető hozzávetőlegesen 0,5 pg/mm2-es, illetve néhány 10 Da-os felületi érzékenységnek. Az előzőfejezetben a bemutatott rácscsatolt interferométer működési elvét refraktometriai kísérletek segítségével bár igazoltam, hangsúlyt fektettem arra is, hogy az összeállítást még jelentős fejlesztésnek kell alávetni ahhoz, hogy a kereskedelemben már kapható jelátalakítók mellett vonzó alternatívát biztosítson. Jelen fejezet célja, hogy bemutassa azokat az újításokat, melyek segítségével a szóban forgó eszköz teljesítőképessége oly mértékben megnövekedett, hogy napjaink legnépszerűbb módszerei közül a legtöbbet maga mögé utasította. Ezen állítás hitelességét a fejezet végén bemutatott, fehérje adszorpciós és a rendkívüli érzékenységet igénylőfelismerőelem - célmolekula megkötési kísérletek eredményeivel bizonyítom A válaszjel kiértékelés új formája A valódi mérések természete, hogy zajjal terheltek, minek következtében a keresett mérési információt csupán valamilyen véges pontossággal olvashatjuk ki rendszerünkből. A jelfeldolgozó eljárások célja minden esetben az, hogy a lehetőlegrosszabb jel/zaj viszonyok mellett is a lehetőlegkisebb bizonytalansággal vezessenek eredményre. Az egyre fejlődő numerikus módszerek között számos olyan zajszűrőeljárást találhatunk, melyek csábító hatékonysággal simítják vagy szűrik a kívánt jelünket. Az ilyen eljárások nyilvánvaló fogyatékossága azonban minden esetben az, hogy a zajos jelben rejlőinformációt a jel utólagos manipulációjával mindig torzítják [83]. A Numerical Recepies in C című, általánosan elismert könyv szerint a lehetőlegjobb eljárás az, ha változatlanul (zajosan) hagyjuk a mért jelünket, s azt, a fenti eljárások helyett, egy alkalmas parametrikus függvénnyel illesztjük, majd a kapott paraméter értékekből meghatározzuk a keresett információt [83]. Ennek előnye nem csupán az, hogy az eredeti, torzulásmentes jelalak képzi a kiértékelés alapját, hanem az is, hogy az összes mért pont része 67

68 a függvényillesztési eljárásnak. (Szélsőérték keresőalgoritmusok általában csak a feltételezett szélsőérték közvetlen környezetében lévőpontokat használják fel.) A mérési pontok száma négyzetgyökével arányosan csökkenti a mérésből származó zajt, javítja a kiértékelés pontosságát. Elegendően nagyszámú mintavételezés esetén kiváló jel/zaj viszony érhetőel még erősen zajjal terhelt válaszjelek esetén is. A fenti érvelés alapján célszerű a rácscsatolt interferométer kimenetén mérhető válaszfüggvényt egy megfelelőparametrikus függvénnyel illeszteni. E függvény kiválasztása azonban nem magától értetődőfeladat. Bonyolult folyamatokat leíró, összetett, nagy számítási kapacitást igénylő, sok paraméterrel rendelkezőmodellek esetén a kiértékelés lassú és bizonytalan lesz. Túl kevés paraméter alkalmazása pedig magában hordozza a veszélyt, hogy modellünk nem illeszkedik majd megfelelően a válaszjelre, melynek következtében a vele kapott eredmény megbízhatatlan lesz. E két eset optimuma adja a legjobb megoldást. A modell függvény megtalálására használjuk fel a függelék Interferencia és a Nematikus folyadékristály modulátor című alfejezeteiben vázolt ismereteket. A folyadékkristály modulátor referenciához viszonyított, a gerjesztőfeszültség megszűnésekor mérhetőfázistolás dinamikáját megkapjuk, ha a ( ) egyenletbe rendre behelyettesítjük a ( ) és ( ) összefüggéseket: d/ 2 2 n e no LCM (t mod ) 1 dy, t mod t mod 0 d /2 ne2 sin 2 0 m e cos no2 cos 2 0m e cos y y m m ahol ( 2m 1), valamint 2, d (8.1.1.) ahol a d vastagságú folyadékkristály relaxációja során, a gerjesztőfeszültség megszűnésétől számított időt t mod, a modulátoron áthaladó fény vákuumbeli hullámhosszát λ 0 jelöli, 0m pedig a γforgási viszkozitással és κrugalmassági együtthatóval jellemezhetőfolyadékkristály molekulák tmod = 0 időpillanatban mért, m-edik módusra vett maximális szögkitérése. A cosinus függvén argumentumában szereplőy ( y d / 2...d / 2 ) paraméter térkoordináta. Amennyiben a fázistolásra kapott értéket a ( ) interferencia egyenletbe írjuk, megkapjuk a modulált és referencia ágakból érkezőnyalábok interferencia válaszjelének időbeli lefutását: 68

69 I (t mod ) I1 I 2 2 I 1 I 2 cos LCM (t mod ) r, (8.1.2.) ahol I az intenzitás, r pedig egy additív, a rendszerre jellemzőfázistag. A (8.1.2.) egyenlet normált változatát az általam fejlesztett MATLAB algoritmussal a szintén normált válaszjelre illeszthetjük. A program a (8.1.1.) integrál egyenletet minden iterációs ciklusban (az aktuális paraméterértékekkel) numerikusan kiintegrálja és összeveti a kísérleti görbével. Az illesztendőparaméterek, d, r és minden 0 m, melyek r kivételével az LCM egység karakterisztikus jellemzői. A modulátor által generált válaszjelre való m = 1 2, két módusos illesztés eredménye a ábrán látható. (A nagyobb módusszám már nem javított számottevően az illesztés jóságán.) ábra: A 4 μ m vastag folyadékkristály-réteggel rendelkezőlcm egység által generált válaszjel idő beli lefutására illesztett elméleti görbe. A betét kép a ΔΦLCM fázistolás idő függését mutatja be. (Az illesztés 270 független adatpontra történt.) A fenti illesztés d paramétere 4,5 μm-nek adódik, ami nagyon jól egyezik a gyártó által megadott 4 μm-es értékkel. A mért pontok elméleti függvényhez képesti szórására csupán 0,036. Mindezek tükrében kijelenthető, hogy az (8.1.1.) és (8.1.2.) összefüggések együttese helyesen és jól írja le a moduláció keltette válaszfüggvényt. Nagy hátránya azonban, hogy mivel e bonyolult egyenlet illesztése rendkívül számolásigényes eljárás, így e modell alkalmazása a gyors kiértékelés gátja. Az ábra betét képe azonban egy sokkal egyszerűbb megoldást is sugall számunkra. A szemre exponenciálisan felfutó fázistolás - időfüggvény intuíció arra, hogy a (8.1.1.) egyenlet helyett egy sokkal egyszerűbb formula is jól modellezheti a vizsgált jelenséget. Ezt indokolja az is, hogy amennyiben t mod szerint sorba fejtük a (8.1.1.) egyenletben szereplőintegrál argumentumát, úgy egy az exponenciális függvény sorfejtéséhez hasonlóan alteráló 69

70 hatványsort kapunk. (A pontos eredmény terjedelmi okokból nem képzi a dolgozat részét.) A fentiek alapján tehát indokolt lehet a következőválasztás is: LCM (t mod ) LCM 1 e tmod / r, (8.1.3.) ahol LCM az a fázistolás, melyet a modulátor a teljesen gerjesztettből a teljesen relaxált állapotából való visszajutása alatt az áthaladó fényen tol, pedig idődimenziójú állandó. Annak eldöntésére, hogy a két függvény közül melyik az alkalmasabb, rendre illesszük azonos válaszjelre a (8.1.2) egyenlet argumentumába helyettesített elméleti és intuitív úton kapott (8.1.1.) és (8.1.3.) összefüggéseket. Ahogy azt a ábra is szemlélteti, az intuitív függvény legalább olyan jól karakterizálja a mért válaszjelet, azonban nagyságrendekkel kisebb számítási időmellett teszi mindezt, mint elméleti társa. Mivel a gyors mintavételezés, így a gyors kiértékelés is, az érzékeny mérések kulcsa, a továbbiakban minden esetben ezt az eljárást alkalmazom ábra: A mért adatokra illesztett elméletei (sötét szürke szaggatott vonal) és intuitív (világos szürke szaggatott vonal) modellek összehasonlítása. Abban az esetben, ha a nagyobb fázistolás érdekében vastagabb (> 4 μm) hasznos folyadékkristály-réteggel rendelkezőlcm egységet alkalmazunk, a válaszjel teljes lefutását általában már nem illeszthetjük azonnal a (8.1.2.)-be helyettesített (8.1.3.) összefüggéssel. Ilyenkor több, a (8.1.3.)-mal azonos, de független paraméterekkel rendelkezőegyenlet lineárkombinációját kell beírnunk a (8.1.2.) egyenletbe. A ábra egy 8 μm hasznos folyadékkristály-réteggel rendelkezőlcm egység segítségével keltett válaszfüggvény egy, illetve két exponenciális taggal illesztett eredményét mutatja. Látható, hogy két exponenciális lineárkombinációja már jól fedi a válaszfüggvényt. 70

71 ábra: Vastagabb, 8 μm hasznos folyadékkristály-réteggel rendelkezőlcm egység válaszfüggvényét egyetlen exponenciális tagot tartalmazó modellel illesztve nem kapunk kielégítő egyezést. Két exponenciális lineárkombinációja azonban már teljesíti ezt a feladatot. (Az illesztés 3822 független adatpontra történt.) Fontos észrevennünk azonban, hogy ilyen nagy fázistolások alkalmazása felesleges, hiszen a kiértékeléshez elegendőminimálisan két szélső érték megléte is. A válaszjel mintavételezési frekvencia, így a rácscsatolt interferométer érzékenysége is növelhető, ha a vezérlőjel frekvenciáját addig növeljük, míg a válaszjelben mérhetőfázistolás alig több mint 2π-re csökken. A modulátor egység ilyen esetben ugyan nem relaxálódik és gerjesztődik teljes mértékben, azonban ez nem gátja a stabil működésnek, sőt a szabad iondiffúzió károsító hatásait is jobban kivédi a gyorsabb vezérlés. Ezen felül továbbá, elegendőegyetlen exponenciálist tartalmazó egyenlet is a válaszjel illesztéséhez ( ábra), mely a kisebb számolásigény miatt gyorsítja, illetve a kevesebb paraméter okán stabilizálja a kiértékelést. A fentiekben részletezett fejlesztések eredménye, hogy az intuitív modell alkalmazása esetén r meghatározásának kiértékelési bizonytalansága tipikusan csupán ~ 10-4 radian. A következőkísérletekben amennyiben a jelenleg elérhetőmaximális mintavételezési teljesítmény szükséges a 12 μm hasznos folyadékkrisztály-réteggel rendelkezőlcm egységet 25 Hz-es vezérlőjelre kacsolom, majd a 200 ks/s mintavételezési frekvencia mellett detektált válaszjelet egyetlen exponenciálist tartalmazó egyenlettel illesztem a tmod = 2,5 ms 20 ms-os tartományban. Fontos megjegyezni, hogy mivel a mért adatok analóg-digitál átalakítóból való kiolvasása szintén prioritást igénylőfolyamat, a válaszjel mintavételezési frekvencia 25 Hz-es vezérlőjel esetén 20 Hz. A kapott fázisértékeket, ahogy azt a rácscsatolt interferométer legnagyobb vetélytársa, a dupla polarizációs interferométer is teszi, 2 másodperces időablakokra átlagolom. 71

72 8. 2. A valós idejűvezérlőés kiértékelőalgoritmus Ahhoz, hogy a rácscsatolt interferométer jelátalakító működőképes, kísérletekben jól használható eszköz legyen, nélkülözhetetlen egy felhasználóbarát, valós idejűeredményeket szolgáltató válaszjel kiértékelőalgoritmus kifejlesztése. Bármely mérés során világos igény az, hogy a mért válaszjelek kiértékeléséről és a szenzorfelületen végbemenőfolyamatról pontos és azonnali visszajelzést kapjunk. Ennek érdekében a mérésvezérlőalgoritmus által begyűjtött, fájlokban eltárolt adatait egy gyors és azonnali kiértékelési folyamatnak kell alávetnünk. Az imént kitűzött feladatot egy általam fejlesztett, MATLAB környezetben futó algoritmus segítségével valósítottam meg, mely működési elvének rövid ismertetése jelen alfejezet tárgya. Amennyiben a rácscsatolt interferométer integrált optikai egységét is csatlakoztatjuk a MachZender interferométer jellegűnyalábosztó rendszerhez, a (8.1.2.) egyenlet kiegészítésre szorul. Ennek oka, hogy a válaszjel fázisát nem csupán (az ideális esetben időben változatlan) r határozza meg, hanem ehhez hozzáadódik még a jelátalakító érzékelőfelület alatt terjedő módus fázisának eltolódásából származó a mérés célját képezőmennyiség (t ) érzékelő felületi fázistolás is. Itt t a kísérlethez tartozó időt jelöli. Ezzel az előzőalfejezetben javasolt intuitív modell a következőalakba írható át: I ( (t ), t mod ) I 0 A cos LCM 1 e tmod / r (t ), (8.2.1.) ahol I 0 I1 I 2 az interferencia válaszjel időben állandó komponense, míg A 2 I1 I 2 az amplitúdója. Amennyiben a mérés során egy t 0 időpillanathoz tartozó fázisértékhez viszonyítjuk az összes további válaszjel fázisát, r kitranszformálható a (8.2.1.) összefüggésből: (t, t 0 ) r (t ) r (t 0 ) (t ) (t 0 ). (8.2.2.) Az ily módon előkészített modellel való kiértékelés eredménye a kiválasztott fázisértékhez viszonyított relatív fázistolás. ( ábra) Megjegyzendő, hogy mivel a kiértékelés bármely időpillanatban indítható, t 0 időpont tetszőlegesen megválasztható. 72

73 ábra: A lassú válaszjel mért pontjai (fekete -ek) rövidebb idő intervallumokon kiválóan illeszthető k az egyetlen exponenciálist tartalmazó intuitív modellel. Egy tetsző legesen kiválasztott válaszfüggvény fázisával definiálható (t, t 0 ) relatív fázistolás. A kis betét képek a folyadékkristály modulátor molekuláinak orientálódását szemléltetik. (Az illeszés görbénként 1226 független adatpontra történt, melyek közül a könnyebb áttekinthető ség kedvéért csupán minden tizedik került ábrázolásra.) ábra: A második generációs rácscsatolt interferométer kiértékelőprogramja a mérés fontos paramétereit valós idő ben ábrázolja a monitoron. 73

74 A valós idejűkiértékelőalgoritmus elsőlépéseként beolvassa a vezérlőprogram által generált, elsőmérési adatokat tartalmazó fájlt. Ezt követően az elsőfelfutó és lefutó vezérlőfeszültség után mérhetőlassú válaszjelekre, az I 0, A, LCM, és (t 0 ) paraméterek keresésével rendre illeszti az (8.2.1.) egyenletben matematikai formát öltött modellt, majd a folyadékkristályra jellemzőkarakterisztikus paramétereket ( LCM, ) és a t 0 időponthoz tartozó fázisértéket lerögzíti, hogy ezzel a Válaszjel kiértékelés új formája címűalfejezetben megadott értékhez képest tovább csökkentse (t ) meghatározásának bizonytalanságát. Minden újabb ciklus a következőmintavételezés eredményét tartalmazó fájl keletkezésének pillanatában indul. Az algoritmus az első ciklusban szabadon hagyott paraméterek illesztésével meghatározza a relatív fázistolást és az illesztés jóságát (a mért görbék illesztettel számolt szórását), majd az új és addigi eredményeket az időfüggvényében ábrázolja a monitoron. ( ábra) A zaj hatásának csökkentése referencia alkalmazásával Az előzőfejezetben láthattuk, hogy a rácscsatolt interferométer ígéretes, költséghatékony eszköze a refraktometriai kísérleteknek, azonban érzékenysége még messze elmarad a legjobb optikai jelátalakítók ~10-6-os teljesítőképességétől. Ennek egyik oka a Mach-Zender egység kellemetlen mellékhatása, miszerint a mérőés referencia ágakban terjedőnyalábok fázisa a hosszú, szabad terjedésűoptikai utak során, a levegőturbulencia és egyéb mechanikus rezgések hatására egymástól függetlenül, időben véletlenszerűen változik. Nagy jelentőségű lenne tehát egy olyan módszer kidolgozása, mely valamilyen módon kiiktatná az innen eredő mérési bizonytalanság jelentős érzékenység csökkentőhatását. A fenti problémára egy aligha járható út az, ha az interferométer szigetelését minden határon túl megerősítjük. Egy másik lehetőség az, ha a szóban forgó egység méreteit jelentős mértékben csökkentjük, vagy egy alkalmas integrált optikai elemmel helyettesítjük. Ennek megvalósítása egyelőre technikai jellegű korlátokba ütközik. Egy egyszerű, könnyen kivitelezhetőmegoldás ellenben a következő: Egy új mérőágat hozunk létre úgy, hogy az interferométerből kilépőpárhuzamos nyaláb intenzitásának néhány százalékát egy megfelelő vastagságú, az integrált optikai egység közvetlen közelébe helyezett plánparalel üveglemez segítségével visszaverve eltérítjük eredeti útvonalából. Ezt követően az üveglemezt olyan szöghelyzetbe forgatjuk, hogy a határfelületeiről reflektálódó párhuzamos nyalábok közül kettő az interferométer különbözőágaiból érkező fedésbe kerüljön egymással, azaz 74

75 ábra: Egy elegendő en vastag plánparalel üveglemez segítségével a párhuzamos nyalábok intenzitásának kis hányada kicsatolható és interferáltatható. Az így keletkezett interferencia válaszjel referenciaként szolgál (referencia interferencia válaszjel). interferáljanak. ( ábra) Ezt a második, referencia interferencia jelet egy második detektorba irányítjuk, majd háromcsatornás méréssel az elsődetektorral mért válaszjellel egyetemben kiértékeljük. A kapott fázisokat egymásból kivonva, a szabad terjedésűszakasz zajhatásainak kiiktatása megvalósítható. ( ábra) Referencia alkalmazásával a rendszert terhelőzaj már főként az integrált optikai egységből és a méréskiértékelés bizonytalanságából adódik. E módszer előnye továbbá az is, hogy az interferométer egységben ébredőnagyfrekvenciás változásokon kívül, a hőmérsékleti hatások alacsonyfrekvenciás jelcsúsztató (ang. drift) hatásait is képes kompenzálni. Referencia alkalmazása ily módon zajjal terhelt környezetben stabilabb és érzékenyebb mérést tesz lehetővé. 75

76 ábra: Háromcsatornás méréssel a szabad fényterjedésű szakasz zajhatásai kiiktathatók Nagy felbontású kísérletek rácscsatolt interferométerrel A jelátalakítók napjaink egyik legfontosabb alkalmazási területe a gyorsan fejlődő, így egyre nagyobb érzékenységet kívánó biológiai felismerőelem - célmolekula típusú kutatások. Az Jelölésmentes érzékelők jelátalakítói címűalfejezetben bemutatott optikai eljárások törésmutató-, illetve adlayer vastagságváltozásra vett érzékenysége egyetlen kivétellel 10-6, illetve néhány pg/mm 2 felett van. Jelen alfejezet tárgya, hogy refraktometriai és biológiai kísérleteken keresztül megvizsgálja az előző alfejezetekben összefoglalt fejlesztések eredményeképp feljavított, második generációs rácscsatolt interferométer teljesítőképességét. Továbbá választ kíván adni arra is, hogy a szóban forgó eszköz hová sorolható be az I. táblázatban felsorolt legnépszerűbb optikai jelátalakítók előkelőtáborában Refraktometria és fehérje adszorpció vizsgálat Biológiai érzékelőfejlesztésének egyik kulcs mozzanata az összeállítás érzékenységének és biológiai vizsgálatokra való alkalmasságának bemutatása. Minden esetben tehát egy olyan egyszerű, közismert és általánosan elfogadott alapkísérletet kell terveznünk, mely sikeres elvégzésével jól megmutathatók a műszer kivételes tulajdonságai. Kollégáimmal egy vegyes, refraktometriai és biológiai egységekből álló kísérletet láttunk ilyennek. Terveink szerint, először ismert törésmutatójú glicerin oldatot áramoltatva át a folyadékcellán meghatározzuk a rendszer törésmutatóra vonatkoztatott felbontását, majd egy tesztfehérje, esetünkben immunglobulin-g (ang. immunoglobulin-g - IgG) szenzorfelületi adszorpcióját követve visszaszámoljuk az adlayer vastagságát és felületi tömegsűrűségét, majd ezeket összevetjük az irodalmi értékekkel. 76

77 A folyadékcellába tehát folyamatos (nem szakaszos), 0,25 ml/perc sebességűáramoltatás mellett rendre a következőoldatokat fecskendeztem be: 1.) foszfát puffer (ang. phosphate buffered saline - PBS), 2.) 1 %-os glicerin - PBS oldat, 3.) foszfát puffer, 4.) 0,2 mg/ml koncentrációjú IgG oldat, majd 5.) foszfát puffer. A felsorolt oldatok átáramoltatásának hatására a második generációs rácscsatolt interferométerrel a ábrán látható görbét mértem ábra: A vegyes refraktometriai és biológiai kísérletben a második generációs rácscsatolt interferométerrel mért kísérleti eredmény. (A fenti mérési görbe 5438 válaszjel feldolgozásából született, melyek egyenként 1225 független adatpontot tartalmaztak.) A kísérlet elsőszakaszában felvett alapvonal meghatározza az interferométer érzékenységét és stabilitását. Az előbbit e szakaszon mérhetőrelatív fázisértékek átlaghoz viszonyított szórásából számolhatjuk, hiszen ennek háromszorosa adja meg a rácscsatolt interferométer (szög)felbontását. Ez az érték 2,7 x 10-3 radian-nak adódik, mely legalább egy nagyságrenddel meghaladja a válaszjel fázisának kiértékelési bizonytalanságát még abban az esetben is, ha elfeledkezünk arról a tényről, hogy az itt ábrázolt fázisértékek 2 másodperces időablakok átlagai. Megállapítható tehát, hogy a kiértékelési eljárás nem korlátozza az érzékenységet. A 77

78 stabilitást az alapvonalon mérhetőjelcsúszás (drift) mértéke tükrözi, mely egy percre vetített értéke kisebb, mint a rendszer felbontása. A második szakaszban a folyadékcellát 1 %-os glicerin - PBS oldattal öblítettem át, melyre a rácscsatolt interferométer válaszjelének (a fentiekben megadott bizonytalanság mellett) 3,9584 radian eltolódásával reagált. Ezt az előzőfejezet mintájára összevetve az oldatok törésmutató különbségével (1,39 x 10-3, meghatározva az 5 tizedesjegyre pontos Rudolph Refractometer-rel) és a mérés felbontásával kapjuk, hogy a rendszer törésmutatóra átszámított érzékenysége jobb, mint Az elsőés második szakasz szerepe nem csupán a felbontás és stabilitás meghatározásában rejlik. A későbbi számítások szempontjából egy rendkívül fontos tényező, mely mindezidáig csak pontatlanul volt meghatározható az érzékelőfelület hossza is megadható a mérés eddig ismertetett paraméterértékei és a hullámvezető opto-geometriai paraméterei alapján. Spektroszkópiai ellipszometriai méréseimre támaszkodva a kísérletben használt integrált optikai egység hullámvezető filmjének és hordozójának törésmutatója a 632,8 nm-es hullámhosszon rendre 1,472 ± 0,001-nek és 2,146 ± 0,002-nek állapítottam meg. A hullámvezetőréteg vastagságára 196,5 ± 0,1 nm-t kaptam. A differenciálás láncszabályának segítségével a (7.4.1.) egyenletet felhasználva a relatív fázistolás a következőalakba írható át: N n k 0 L Sc nc, N nc c (8.4.1.) ahol Sc 0,149, a módusegyenlet (ld.: Hullámvezetés izotróp közegben ) segítségével a fentiekben ismertetett hullámvezetőparaméterértékekbő l numerikusan meghatározott, a fedőnc törésmutatójának megváltozására mutatott érzékenység. A (8.4.1.) egyenletbe történő behelyettesítéssel adódik, hogy az érzékelőfelület hossza 1,8 mm, mely jól egyezik az egyéb (terjedelmi okokból nem ismertetett) jóval pontatlanabb mérési eljárások eredményeivel. Az 1 %-os glicerin - PBS oldatot visszamosva tiszta PBS oldattal a válaszjel fázisa visszatér eredeti, kezdeti állapotába ezzel bizonyítva az összeállítás kiváló reverzibilitását és új alapvonalat szolgáltatva a mérés következő, biológiai részének. A mérés negyedik szakaszában az IgG-t tartalmazó foszfát puffer oldat árama éri az érzékelő felületet, mely hatására megkezdődik a fehérje adszorpciója. A felületen növekvőfehérje vékonyréteg megváltoztatja a rendszer effektív törésmutatóját, így eltolja a válaszjel fázisát is. 78

79 Amennyiben a keletkezővékonyréteg vastagságát da-val jelöljük, a relatív fázistolást az előző egyenlet mintájára a következőalakban írhatjuk fel: N d A k 0 L SA d A, N d A (8.4.2.) ahol SA 2,2 x 10-4 nm-1 a hullámvezetőparaméterértékeiből a módusegyenlet segítségével numerikusan meghatározott, a felületen növekvőadlayer da vastagságának megváltozására adott érzékenység. Érdemes a szóban forgó felfutó szakaszra exponenciálist illesztenünk, mert ekkor a kapott paraméterértékekből könnyedén meghatározhatjuk a fehérje adszorpció telítési értékét. Az illesztés alapján ΔΦ = 27,238 ± 0,046 radian, mely érték hibája vezetőrendben az illesztés bizonytalanságából adódik. A fehérjeréteg törésmutatóját szakirodalmi adatok alapján na = 1,46-nak feltételezhető [71]. Ezeket az értékeket a (8.4.2.) egyenletbe helyettesítve a felületre adszorbeált (homogén és izotrópnak vélelmezett) IgG vékonyréteg telítődésekor mérhetővastagságára 6,8 nm-t kapunk. A felületi tömegsűrűséget a de Feijter formula adja: d A n A nc, dn / dc (8.4.3.) ahol dn/dc értéke szintén szakirodalmi adatok alapján 0,18 cm 3/g-nak vehető[67]. A megfelelőértékeket a (8.4.3.)-as összefüggésbe helyettesítve a felületre adszorbeálódott fehérjeréteg felületi tömegsűrűsége 4,8 ng/mm2. Mind a fehérjeréteg vastagságára, mind a felületi tömegsűrűségére kapott értékek jól egyeznek a tudományos irodalomban feljegyzettekkel [71]. Végül az utóbbiból könnyen meghatározhatjuk a rendszer felületi tömegsűrűségre vett felbontását. Ez az érték a fentiekben már ismertetett, egyszerű matematikai kalkulációból 0,5 pg/mm2 -nek adódik. Megjegyzendő, hogy felhasználva a fehérje molekulatömegét ( 160 kda), valamint a fentiekben meghatározott felületi tömegsűrűségét, az egyetlen IgG-re jutó átlagos felületegység 55 nm2-nek adódik telítődéskor. Az ötödik szakaszban történőpbs mosást követően ez az érték 68 nm2-re nő, azonban ezt összevetve a fehérje méretével ( 7 nm x 10 nm x 2 nm) kijelenthető, hogy még ekkor is egy viszonylag sűrűigg réteg található a Ta2O5 film felszínen. 79

80 Az elsőkísérlet tehát bizonyította, hogy a második generációs rácscsatolt interferométer érzékenységben messze felülmúlja az előzőfejezetben ismertetett elsőprototípust, igazolva ezzel a fejlesztések jelentős, előre mozdító hatását. A mérésből számított, fehérjerétegre vonatkoztatott vastagság és felületi tömegsűrűség értékek az irodalmi adatokkal összecsengenek, mely alapján kijelenthető, hogy a rácscsatolt interferométer ígéretes jelöltje a rendkívüli érzékenységet és hitelességet igénylő felismerő elem - célmolekula típusú kísérletek jelátalakító eszközének. Azt, hogy az ígéretes jelző kiváló -ra cserélhető, egy második kísérlet eredményeivel igazolom Felismerőelem - célmolekula típusú érzékelés Napjaink gyógyszerkutatási törekvései olyan nano-hatóanyag jelöltek vizsgálatára összpontosítanak, melyekre jellemző, hogy néhány tíz- vagy százezer Dalton molekulatömegű felismerőelemekkel kölcsönható, 500 Da-nál kisebb tömegűcélmolekulák. Így tehát az igény jelentős egy olyan jelátalakító eljárásra, mely képes az ilyen parányi célmolekulák hatalmas felismerőelemekhez való specifikus bekötődését is felbontani [58]. Az avidin-biotin rendszerek megkapó tulajdonsága, hogy alkotóik rendkívül erősen kötnek egymáshoz, disszociációs állandójuk hozzávetőlegesen M. E tulajdonság és az elmúlt két évtized intenzív kutatása e kölcsönható fehérjékből építkezve hatékony eszközöket hozott létre a biológia, biokémia és biotechnológia tudományterületeit kutatók számára például a különböző lokalizációs, orvos diagnosztikai és rekombináns géntechnológiai eljárások területén [65]. Mivel az avidin-biotin kötés olyan erős, hogy ezzel nem versenyezhet egyetlen más, az oldatból odajutó molekula sem, kiváló tesztfehérjéi az új jelátalakító eljárásoknak. Tekintve, hogy az avidin molekula tömege 66 kda, ezzel szemben a biotiné ennél 270-szer kisebb, csupán 244 Da [84], kutatók gyakran a biotinnal beborított érzékelőfelülethez kötődő avidin jelét mérik, vagy az ún. biotinilált (biotinnal jelölt) molekulák (oligonukleotidek, antitestek, vezikulák) érzékelőfelülethez rögzített (immobilizált) avidinekhez való kötését követik nyomon [7]. Világos, hogy a nagyobb kihívás az, ha a felülethez először az avidint immobilizáljuk, majd az apró biotin bekötődésének jelét mérjük. Az a jelátalakító eljárás, amelyik képes felbontani ezt a parányi effektust, jó eséllyel bármely más biológiai kölcsönhatás vizsgálatának hatékony eszköze lesz. A következőkísérletben a rácscsatolt interferométer kiváló teljesítőképességét kívánom bizonyítani az imént felvezetett kölcsönhatás kimérésével. A kísérlet menete a következővolt: Az érzékelőfelületet Dr. Kurunczi Sándor 3-aminopropiltrietoxi-szilánnal (APTES) előkezelte, majd az így aktivizált integrált optikai egységet 80

81 azonnal a PBS pufferrel feltöltött folyadékcella alá helyeztem. 1.) A puffer 1 ml/perc sebességű, folytonos áramoltatása mellett felvettem az alapvonalat, majd 2.) 2,5%-os glutáraldehid keresztkötő(ga) - PBS oldatot fecskendeztem a folyadékcellába. 3.) A felületet átöblítettem tiszta puffer oldattal, hogy a felesleges GA molekulák távozzanak a rendszerből, és így megfelelőalapvonalat kapjak a 4.) 0,1 mg/ml koncentrációjú puffer oldatban feloldott avidin felületi immobilizációjának kiméréséhez. Az avidin immobilizáció lassú szakaszát megszakítva 5.) hosszan, PBS oldat áramával távolítottam el a felülethez nem megfelelően kötött avidin molekulákat. 6.) A stabilizálódott felületi rétegre 1 μg/ml koncentrációjú biotin oldatot juttattam. A kísérlet eredményét a ábra szemlélteti. (A fentiekben alkalmazott immobilizációs eljárásról bővebben a Mintakészítés címűalfejezetben olvashatunk.) ábra. Az APTES - GA aktivált érzékelőfelületre immobilizált avidin a biotin oldat áramában specifikusan megköti célmolekuláját (betét kép). (A fenti mérési görbe szakaszában 6340, míg a 6.-ban 7330 válaszjel feldolgozásából született, melyek egyenként 1225 független adatpontot tartalmaztak.) A továbbiak szempontjából fontos tudnunk, hogy egyetlen avidin molekula négy biotin kötőhellyel rendelkezik [85]. Az immobilizáció során azonban az avidin fehérjék 81

82 véletlenszerűen orientálódva rögzülnek a felszínhez, így nem valószínű, hogy az összes kötőhely szabadon hozzáférhető. Lássuk, milyen értékre következtethetünk a ábrán látható kísérlet elemzéséből! Mivel előzőleg már igazoltuk a rácscsatolt interferométer linearitását, stabilitását és hitelességét, a harmadik és az ötödik szakaszban mért alapvonalakhoz tartozó fázis értékek különbsége a felületre immobilizált avidin molekulák, biotin oldat beáramlásának pillanatában mérhetőmennyiségével arányos kell legyen. A mérési adatokból kiolvasható relatív fáziskülönbség (természetesen az előzőalfejezetben megállapított mérési hibával terhelve) 17,2453 radiannak adódik. A hatodik szakaszban mért fázisugrás a biotin oldat folyadékcellába való beáramlásakor mért jel, melyet a ábra betét képén kinagyított formában is szemügyre vehetünk. Megfigyelhetjük, hogy a kezdeti, hirtelen jelemelkedést egy lassabb csökkenés követi. Egy pillanatra elhalasztva e szokatlan viselkedés magyarázatát illesszünk az f (x ) A1 e x / 1 A2 e x / 2 c (8.4.4) alakú függvényt a mért pontokra, hogy a két, egymással átfedőjelenséget szétválaszthassuk. ( a. ábra) A1 illetve A2 a különbözőelőjelűváltozások amplitúdója, 1 és 2 ezek karakterisztikus időállandója, c pedig egy konstans additív tag. Az illesztés eredménye szerint az emelkedő szakasz amplitúdója 9,9 x 10-2 radian, mely hozzávető legesen fele a csökkenőének. A kritikus időállandókra kapjuk, hogy az előbbihez tartozó körülbelül 4 másodperc, míg az utóbbit jellemzőhozzávetőlegesen 5 perc. Egyszerűaránypárokat véve, a biotinhoz és avidinhoz tartozó relatív fázistolás és molekulatömeg értékek arányának hányadosa adja, hogy egyetlen avidin átlagosan 1,55 ± 0,02 biotint kötött meg. A 4 másodperces jelnövekedés pedig jól tükrözi az avidin és biotin molekulák egymáshoz való rendkívüli affinitását. Amennyiben összevetjük az a. ábrán látható mérési eredményt a b. ábrán bemutatott, Konopsky és Alieva által kifejlesztett fotonikus kristály felületi hullám (ang. photonic crystal surface wave - PC SW) bioszenzorral hasonló biológiai rendszeren mért eredménnyel [86], a szembeötlő nagyfokú egyezés is alátámasztja a rácscsatolt interferométer mérési eredményeit. Végül a biotin bekötődéshez tartozó relatívfázistolás értékből a szokott módon meghatározható, hogy az interferométer akár már néhány 10 Da molekulatömegűcélmolekulák bekötődését is képes detektálni. 82

83 ábra: a.) Rácscsatolt interferométerrel, b.) fotonikus kristály felületi hullám bioszenzorral mért, a biotin megkötés hatására kapott jel. Fontos kitérnünk egy megjegyzés erejéig a következőre is: a fenti kísérletben szereplőbiotin molekulákról nem állítható teljes bizonyossággal, hogy mindegyik, kivétel nélkül valamelyik avidin kötőhelyhez kapcsolódik. Elképzelhetőtehát, hogy vannak köztük olyanok is, melyek máshol találnak maguknak helyet, s mi így a valódi pozitív kötési események mellett álpozitívokat is számításba veszünk. Ezek aránya azonban várhatóan kicsi, a mérési bizonytalanság mellett elhanyagolható érték kell legyen. Ezt három érv is alátámasztja: 1.) E két molekula kölcsönhatása rendkívül erős, így egy avidinnel sűrűn fedett felület esetén a párok kapcsolódása erősen preferált folyamat kell legyen. 2.) Az egyetlen avidin molekulára jutó biotin szám a maximális 4 helyett csupán átlagosan 1,55. 3.) A biotin molekulák érkezésének hatására a jelátalakító válaszjelének fázisa egy nagyon dinamikus, 4 másodperces kritikus időállandóval jellemezhetőugrással válaszol, melyet egy adszorbeálódó réteg esetén aligha tapasztalhatnánk. A biotin molekulák hirtelen bekötődését követőlassabb jelcsökkenés egyértelműmagyarázata e dolgozatban foglaltak alapján nem adható meg. Megfelelően alátámasztott okfejtéshez számos további jól tervezett és jól kivitelezett egyéb mérés szükséges. Érdemes lenne megvizsgálni, hogy a tapasztalt jelenséget esetleg a biotin bekötődésének valamilyen következményeként a felületről leváló avidin molekulák (esetleg avidin - biotin egységek) okozzák-e. Egy másik érdekesnek tűnővizsgálat tárgya lehetne, hogy a biotin bekötődésének hatására az avidin fehérje válaszolhat-e olyan konformációváltozással, mely a válaszjel fázisának a fentiekben bemutatott csökkenését okozza. 83

84 8. 5. Összegezés és kitekintés A fenti eredményeket összegezve elmondható, hogy a második generációs rácscsatolt interferométer törésmutató felbontása jobb, mint 10-6, felületi tömegsűrűség érzékenysége hozzávetőlegesen 0,5 pg/mm2, illetve segítségével akár néhány 10 Da molekulatömegű célmolekulák bekötődése is nyomon követhető. Az itt felsorolt paraméterek alapján kijelenthető, hogy e bioszenzor egyetlen kivétellel felülmúlja korunk legnépszerűbb, legelterjedtebb optikai jelátalakítóit. (vö.: I. táblázat) Bár a dupla polarizációs interferométerek teljesítőképessége jelenleg még valamivel jobb az általam kifejlesztett műszerénél, azonban a következő bekezdésben összefoglalt fejlesztési tervek mielőbbi megvalósításával a rácscsatolt interferométer érzékenysége várhatóan még legalább egy nagyságrenddel javítható lesz. Mivel az elme gyakran gyorsabb az ötleteket valóra váltani képes kezeknél, számos elméletben már megoldott probléma vár még kivitelezésre. Ezek közül néhány, mely a közeljövőben várhatóan legalább még egy nagyságrenddel javítja a rácscsatolt interferométer felbontását, illetve segíti versenyképességét azok a következők: Hullámvezető rétegek minőségének fejlesztésével jobb nyalábszeparáció érhető el, mellyel egyenes arányban növelhetőa felbontás is. Új, célorientált vezérlőelektronika kifejlesztésével optimalizált mintavételezés lesz majd megvalósítható, melytől szintén érzékenységnövelőhatást várunk. Hőmérsékletstabilizált folyadékcellákkal, (később mikrofluidikával) akár kedvezőtlenebb, nem laboratóriumi körülmények között is mérhetünk majd. Egy új generációs, rácscsatolók rendszerével ellátott integrált optikai chip, ún mikrotitráló lap segítségével nagyszámú mérés lesz majd végezhető egy időben. Egyszerűen használható grafikus felületű vezérlő szoftverekkel kívánjuk majd segíteni az alkalmazás orientált felhasználókat. Végezetül megemlíteném, hogy távlati célunk a két módusos (TE, TM) és a több hullámhosszas mérési összeállítások kifejlesztése is. Egyelőre csupán homályos vágyálom, a 100%-ig integrált optikai rácscsatolt interferométer megalkotása. 84

85 9. Rácscsatolt interferométer - spektroszkópiai ellipszométer kombinált összeállítás Jelen fejezet a rácscsatolt interferométer és spektroszkópiai ellipszométer integrálásából megszületett kombinált mérőberendezés szerkezeti vázlatát és elsőmérési eredményeit mutatja be. Az eszköz lényege, hogy a kisebb érzékenységű spektroszkópiai ellipszométer folyadékfázison (folyadékcellán) keresztül, széles hullámhossz-tartományon mérve meghatározza a hordozó felületén épülővékonyréteg opto-geometriai paramétereit, míg a kiemelkedőfelbontással jellemezhetőrácscsatolt interferométer a hordozó felől detektálva feltárja a vizsgált folyamat apró változásait. E két eszköz kombinációja tehát érzékenyebb és információban gazdagabb eredményeket szolgáltat, mint tennék azt külön-külön. A fejezetben ismertetett fehérje adszorpciós kísérlet igazolja, hogy már ez az első prototípus is 5 pg/ mm2-es felületi és néhány 10 pg/mm2 mélységbeli érzékenységgel képes detektálásra úgy, hogy közben mindkét mérési eljárás előnyei megtarthatók. Az érzékelők előnyei nem csupán teljesítőképességükkel, árukkal és méretükkel fejezhetők ki. Rendkívül fontos tulajdonságuk lehet a más eszközökkel való kombinálhatóságuk is, hiszen a jól megválasztott műszerek összeépítésével az egyedi hiányosságok kiküszöbölhetők. A szakirodalom számos olyan hibrid műszerről számol be, melyek esetén valamely eljárás jelét erősíti fel egy másik. Ilyen például a felületi plazmon rezonanciával érzékenyített ellipszometria [16], az interferometrikus fázismodulált ellipszometria [87], illetve a rácscsatolt interferometria is. Meglepő azonban, hogy kevesebbet olvashatunk olyan kombinált készülékekről, amelyek azonos pontban, két eljárással való mérést tesznek lehetővé egy időben. Jól kiválasztott technikák ilyen jellegűösszeházasításának előnye minden esetben az, hogy a két eljárás által függetlenül szolgáltatott mérési adatok egymást kiegészítve részletesebb folyamatanalízist tesznek lehető vé. Tekintsük példának a kvarc kristály mikromérleg és az ellipszometria kombinációját [46, 88], mely lehetővé teszi a felületre leváló anyag tömegének és a létrejött vékonyréteg struktúra opto-geometriai paramétereinek egyidejűés érzékeny mérését. A dolgozatban bemutatott rácscsatolt interferométer nem tartalmaz mozgó alkatrészeket, így könnyen összeépíthetőmás eszközökkel. A kérdés tehát az, hogy mely mérési eljárásokkal történőa kombinációja lenne előnyös? A spektroszkópiai ellipszométer számos ok miatt hatékony kiegészítője, komplementere lehet a rácscsatolt interferométernek. Mindkettőgyors 85

86 roncsolásmentes optikai eljárás, így kombinációjuk szintén alkalmas gyors folyamatok nyomon követésére. A kisebb érzékenységűspektroszkópiai ellipszométer folyadékfázison (folyadékcellán) keresztül, széles hullámhossztartományon mérve meghatározza az összetett vékonyréteg-rendszerek opto-geometriai paramétereit. A kiemelkedő felbontással jellemezhetőrácscsatolt interferométer hordozó felől detektálva feltárja a vizsgált folyamat apró változásait, azonban összetett rétegrendszerek esetén nem képes feltárni azok részleteit. E két eszköz együttese tehát érzékenyebb és információban gazdagabb eredményeket szolgáltat, mint tennék azt külön-külön. Mivel a rácscsatolt interferométer érzékenysége a felületközeli tartományokra koncentrált, az ellipszometria azonban a teljes fényúton detektál, szellemes kísérletek tervezése esetén elképzelhetőaz is, hogy az eddig elválaszthatatlan folyamatokat alkotóikra bontsunk A mérési összeállítás Doktori munkám keretében, egy olyan rácscsatolt interferométer - spektroszkópiai ellipszométer kombinált összeállítást építettem, mely segítségével azonos pontban, két különbözőoptikai jelátalakító eljárással követhetőnyomon egy időben a vizsgálni kívánt folyamat. A kísérleteket az előzőfejezetekhez hasonlóan most is a rácscsatolt interferométer integrált optikai egységére illesztett folyadékcellában végeztem. Az egyetlen különbség, hogy az itt alkalmazott cella két kvarc ablakkal is rendelkezik, hogy az ellipszométer vizsgáló fénynyalábja szintén érhesse az érzékelőfelületet, illetve, hogy innen visszaverődve a detektorba juthasson. ( ábra) Fontos megjegyezni, hogy az ellipszométerek folyadékcellái technikai okokból egyetlen fix, azonban (0 és 75 között) szabadon megválasztható beesési szögre tervezhetők. Ennek értékét a későbbiekben használt oldatok és a hullámvezetőoptikai tulajdonságainak ismeretében úgy optimalizálhatjuk, hogy a lehető legnagyobb érzékenység mellett mérhessünk majd a kísérletek során. Szimulációk alapján a beesési szög értékét 55 -ban határoztuk meg. E kombinált műszer megtervezésekor két tényezőt kellett szigorúan figyelembe vennem. Az elsőaz, hogy a forgó alkatrészeket tartalmazó ellipszométer fejek (fényforrás, detektor) semmiképp sem lehetnek direkt mechanikai kapcsolatban az optikai asztallal, mert az ezen megépített rácscsatolt interferométer felbontása azok rezgést keltőhatása miatt jelentősen csökkenne még referencia alkalmazása esetén is. A második, hogy a beállíthatóság érdekében, az összeállítás minden eleme finoman, egymástól függetlenül pozícionálható kell legyen a fényutaknak megfelelően, még teljesen összeszerelt állapotban is. 86

87 ábra: A rácscsatolt interferométer - spektroszkópiai ellipszométer kombinált mű szer jelátalakító egységének sematikus vázlata. a.) b.) ábra: A megvalósított rácscsatolt interferométer - spektroszkópiai ellipszométer kombinált műszer kísérleti elrendezése látható az a.) ábrán. A felső, fehér ellipszissel határolt rész nagyított formában a b.) ábrán tekinthetőmeg. 87

Biomolekuláris nanotechnológia. Vonderviszt Ferenc PE MÜKKI Bio-Nanorendszerek Laboratórium

Biomolekuláris nanotechnológia. Vonderviszt Ferenc PE MÜKKI Bio-Nanorendszerek Laboratórium Biomolekuláris nanotechnológia Vonderviszt Ferenc PE MÜKKI Bio-Nanorendszerek Laboratórium Az élő szervezetek példája azt mutatja, hogy a fehérjék és nukleinsavak kiválóan alkalmasak önszerveződő molekuláris

Részletesebben

KEZDŐLAP ARCHÍVUM IMPRESSZUM KERESÉS

KEZDŐLAP ARCHÍVUM IMPRESSZUM KERESÉS 1 / 7 2015.10.19. 13:32 A Magyar Tudományos Akadémia folyóirata. Alapítva: 1840 KEZDŐLAP ARCHÍVUM IMPRESSZUM KERESÉS OPTIKAI BIOÉRZÉKELÉS X Kozma Péter PhD, tudományos munkatárs, MTA Energiatudományi Kutatóközpont

Részletesebben

Bio-nanorendszerek. Vonderviszt Ferenc. Pannon Egyetem Nanotechnológia Tanszék

Bio-nanorendszerek. Vonderviszt Ferenc. Pannon Egyetem Nanotechnológia Tanszék Bio-nanorendszerek Vonderviszt Ferenc Pannon Egyetem Nanotechnológia Tanszék Technológia: képesség az anyag szerkezetének, az anyagot felépítő részecskék elrendeződésének befolyásolására. A technológiai

Részletesebben

Molekuláris biológiai eljárások alkalmazása a GMO analitikában és az élelmiszerbiztonság területén

Molekuláris biológiai eljárások alkalmazása a GMO analitikában és az élelmiszerbiztonság területén Molekuláris biológiai eljárások alkalmazása a GMO analitikában és az élelmiszerbiztonság területén Dr. Dallmann Klára A molekuláris biológia célja az élőlények és sejtek működésének molekuláris szintű

Részletesebben

Az áramlási citométer és sejtszorter felépítése és működése, diagnosztikai alkalmazásai

Az áramlási citométer és sejtszorter felépítése és működése, diagnosztikai alkalmazásai Az áramlási citométer és sejtszorter felépítése és működése, diagnosztikai alkalmazásai Az áramlási citométer és sejtszorter felépítése és működése Kereskedelmi forgalomban kapható készülékek 1 Fogalmak

Részletesebben

Mérés és adatgyűjtés

Mérés és adatgyűjtés Mérés és adatgyűjtés 7. óra Mingesz Róbert Szegedi Tudományegyetem 2013. április 11. MA - 7. óra Verzió: 2.2 Utolsó frissítés: 2013. április 10. 1/37 Tartalom I 1 Szenzorok 2 Hőmérséklet mérése 3 Fény

Részletesebben

TRIPSZIN TISZTÍTÁSA AFFINITÁS KROMATOGRÁFIA SEGÍTSÉGÉVEL

TRIPSZIN TISZTÍTÁSA AFFINITÁS KROMATOGRÁFIA SEGÍTSÉGÉVEL TRIPSZIN TISZTÍTÁSA AFFINITÁS KROMATOGRÁFIA SEGÍTSÉGÉVEL Az egyes biomolekulák izolálása kulcsfontosságú a biológiai szerepük tisztázásához. Az affinitás kromatográfia egyszerűsége, reprodukálhatósága

Részletesebben

FLAGELLINALAPÚ MOLEKULÁRIS OBJEKTUMOK LÉTREHOZÁSA. Sebestyén Anett

FLAGELLINALAPÚ MOLEKULÁRIS OBJEKTUMOK LÉTREHOZÁSA. Sebestyén Anett Pannon Egyetem Műszaki Informatikai Kar Nanotechnológia Tanszék FLAGELLINALAPÚ MOLEKULÁRIS OBJEKTUMOK LÉTREHOZÁSA Doktori (PhD) értekezés tézisei Sebestyén Anett Környezettudományok Doktori Iskola Témavezető:

Részletesebben

International GTE Conference MANUFACTURING 2012. 14-16 November, 2012 Budapest, Hungary. Ákos György*, Bogár István**, Bánki Zsolt*, Báthor Miklós*,

International GTE Conference MANUFACTURING 2012. 14-16 November, 2012 Budapest, Hungary. Ákos György*, Bogár István**, Bánki Zsolt*, Báthor Miklós*, International GTE Conference MANUFACTURING 2012 14-16 November, 2012 Budapest, Hungary MÉRŐGÉP FEJLESZTÉSE HENGERES MUNKADARABOK MÉRETELLENŐRZÉSÉRE Ákos György*, Bogár István**, Bánki Zsolt*, Báthor Miklós*,

Részletesebben

Transzformátor rezgés mérés. A BME Villamos Energetika Tanszéken

Transzformátor rezgés mérés. A BME Villamos Energetika Tanszéken Transzformátor rezgés mérés A BME Villamos Energetika Tanszéken A valóság egyszerűsítése, modellezés. A mérés tervszerűen végrehajtott tevékenység, ezért a bonyolult valóságos rendszert először egyszerűsítik.

Részletesebben

Rövid ismertető. Modern mikroszkópiai módszerek. A mikroszkóp. A mikroszkóp. Az optikai mikroszkópia áttekintése

Rövid ismertető. Modern mikroszkópiai módszerek. A mikroszkóp. A mikroszkóp. Az optikai mikroszkópia áttekintése Rövid ismertető Modern mikroszkópiai módszerek Nyitrai Miklós 2010. március 16. A mikroszkópok csoportosítása Alapok, ismeretek A működési elvek Speciális módszerek A mikroszkópia története ld. Pdf. Minél

Részletesebben

Kutatási beszámoló. 2015. február. Tangens delta mérésére alkalmas mérési összeállítás elkészítése

Kutatási beszámoló. 2015. február. Tangens delta mérésére alkalmas mérési összeállítás elkészítése Kutatási beszámoló 2015. február Gyüre Balázs BME Fizika tanszék Dr. Simon Ferenc csoportja Tangens delta mérésére alkalmas mérési összeállítás elkészítése A TKI-Ferrit Fejlsztő és Gyártó Kft.-nek munkája

Részletesebben

Patkó Dániel. Tézisfüzet. Pannon Egyetem Molekuláris- és Nanotechnológiák Doktori Iskola

Patkó Dániel. Tézisfüzet. Pannon Egyetem Molekuláris- és Nanotechnológiák Doktori Iskola Patkó Dániel Nagyérzékenységű jelölésmentes bioszenzorika: optikai, mikrofluidikai fejlesztések a fehérjék, baktériumok és extracelluláris vezikulák felületi kitapadásainak detektálásához Tézisfüzet Pannon

Részletesebben

TDK lehetőségek az MTA TTK Enzimológiai Intézetben

TDK lehetőségek az MTA TTK Enzimológiai Intézetben TDK lehetőségek az MTA TTK Enzimológiai Intézetben Vértessy G. Beáta egyetemi tanár TDK mind 1-3 helyezettek OTDK Pro Scientia különdíj 1 második díj Diákjaink Eredményei Zsűri különdíj 2 első díj OTDK

Részletesebben

A módszerek jelentősége. Gyors-kinetika módszerek. A módszerek közös tulajdonsága. Milyen módszerekről tanulunk?

A módszerek jelentősége. Gyors-kinetika módszerek. A módszerek közös tulajdonsága. Milyen módszerekről tanulunk? Gyors-kinetika módszerek módszerek jelentősége 2010. március 9. Nyitrai Miklós biológiai mechanizmusok megértése; iológiai folyamatok időskálája; Vándorló melanocita (Victor SMLL). ms skálán való mérések.

Részletesebben

Új irányok a biomolekuláris felismerés detektálásában

Új irányok a biomolekuláris felismerés detektálásában Magyar Kémiai Folyóirat - Előadások 133 Új irányok a biomolekuláris felismerés detektálásában GYURCSÁNYI E. Róbert a* Budapesti Műszaki és Gazdaságtudományi Egyetem, Általános és Analitikai Kémiai Tanszék,

Részletesebben

Tartalomjegyzék LED hátterek 3 LED gyűrűvilágítók LED sötét látóterű (árnyék) megvilágítók 5 LED mátrix reflektor megvilágítók

Tartalomjegyzék LED hátterek 3 LED gyűrűvilágítók LED sötét látóterű (árnyék) megvilágítók 5 LED mátrix reflektor megvilágítók 1 Tartalomjegyzék LED hátterek 3 LED gyűrűvilágítók 4 LED sötét látóterű (árnyék) megvilágítók 5 LED mátrix reflektor megvilágítók 6 HEAD LUXEON LED vezérelhető reflektorok 7 LUXEON LED 1W-os, 3W-os, 5W-os

Részletesebben

A hiperspektrális képalkotás elve

A hiperspektrális képalkotás elve Távérzékelési laboratórium A VM MGI Hiperspektrális laborja korszerű hardveres és szoftveres hátterére alapozva biztosítja a távérzékelési technológia megbízható hazai és nemzetközi szolgáltatását. Távérzékelés

Részletesebben

Módszer az ASEA-ban található reaktív molekulák ellenőrzésére

Módszer az ASEA-ban található reaktív molekulák ellenőrzésére Módszer az ASEA-ban található reaktív molekulák ellenőrzésére Az ASEA-ban található reaktív molekulák egy komplex szabadalmaztatott elektrokémiai folyamat, mely csökkenti és oxidálja az alap sóoldatot,

Részletesebben

KOMPLEX RONCSOLÁSMENTES HELYSZÍNI SZIGETELÉS- DIAGNOSZTIKA

KOMPLEX RONCSOLÁSMENTES HELYSZÍNI SZIGETELÉS- DIAGNOSZTIKA Budapesti i Műszaki és Gazdaságtudományi Egyetem KOMPLEX RONCSOLÁSMENTES HELYSZÍNI SZIGETELÉS- DIAGNOSZTIKA MEE VÁNDORGYŰLÉS 2010. Tamus Zoltán Ádám, Cselkó Richárd tamus.adam@vet.bme.hu, cselko.richard@vet.bme.hu

Részletesebben

Hiszterézis: Egy rendszer kimenete nem csak az aktuális állapottól függ, hanem az állapotváltozás aktuális irányától is.

Hiszterézis: Egy rendszer kimenete nem csak az aktuális állapottól függ, hanem az állapotváltozás aktuális irányától is. 1. Mi az érzékelő? Definiálja a típusait (belső/külső). Mit jelent a hiszterézis? Miért nem tudunk közvetlenül mérni, miért származtatunk? Hogyan kapcsolódik össze az érzékelés és a becslés a mérések során?

Részletesebben

Akusztikai tervezés a geometriai akusztika módszereivel

Akusztikai tervezés a geometriai akusztika módszereivel Akusztikai tervezés a geometriai akusztika módszereivel Fürjes Andor Tamás BME Híradástechnikai Tanszék Kép- és Hangtechnikai Laborcsoport, Rezgésakusztika Laboratórium 1 Tartalom A geometriai akusztika

Részletesebben

Mérés spektroszkópiai ellipszométerrel

Mérés spektroszkópiai ellipszométerrel Mérés spektroszkópiai ellipszométerrel Bevezetés Az ellipszometria egy igen sokoldalú, nagypontosságú optikai módszer vékonyrétegek dielektromos tulajdonságainak meghatározására. Mivel optikai módszer,

Részletesebben

Atomi er mikroszkópia jegyz könyv

Atomi er mikroszkópia jegyz könyv Atomi er mikroszkópia jegyz könyv Zsigmond Anna Julia Fizika MSc III. Mérés vezet je: Szabó Bálint Mérés dátuma: 2010. október 7. Leadás dátuma: 2010. október 20. 1. Mérés leírása A laboratóriumi mérés

Részletesebben

Méréstechnika. Rezgésmérés. Készítette: Ángyán Béla. Iszak Gábor. Seidl Áron. Veszprém. [Ide írhatja a szöveget] oldal 1

Méréstechnika. Rezgésmérés. Készítette: Ángyán Béla. Iszak Gábor. Seidl Áron. Veszprém. [Ide írhatja a szöveget] oldal 1 Méréstechnika Rezgésmérés Készítette: Ángyán Béla Iszak Gábor Seidl Áron Veszprém 2014 [Ide írhatja a szöveget] oldal 1 A rezgésekkel kapcsolatos alapfogalmak A rezgés a Magyar Értelmező Szótár megfogalmazása

Részletesebben

3D - geometriai modellezés, alakzatrekonstrukció, nyomtatás

3D - geometriai modellezés, alakzatrekonstrukció, nyomtatás 3D - geometriai modellezés, alakzatrekonstrukció, nyomtatás 15. Digitális Alakzatrekonstrukció Méréstechnológia, Ponthalmazok regisztrációja http://cg.iit.bme.hu/portal/node/312 https://www.vik.bme.hu/kepzes/targyak/viiiav54

Részletesebben

A nanotechnológia mikroszkópja

A nanotechnológia mikroszkópja 1 Havancsák Károly, ELTE Fizikai Intézet A nanotechnológia mikroszkópja EGIS 2011. június 1. FEI Quanta 3D SEM/FIB 2 Havancsák Károly, ELTE Fizikai Intézet A nanotechnológia mikroszkópja EGIS 2011. június

Részletesebben

Részecske azonosítás kísérleti módszerei

Részecske azonosítás kísérleti módszerei Részecske azonosítás kísérleti módszerei Galgóczi Gábor Előadás vázlata A részecske azonosítás létjogosultsága Részecske azonosítás: Módszerek Detektorok ALICE-ból példa A részecskeazonosítás létjogosultsága

Részletesebben

7. Laboratóriumi gyakorlat KIS ELMOZDULÁSOK MÉRÉSE KAPACITÍV ÉS INDUKTÍV MÓDSZERREL

7. Laboratóriumi gyakorlat KIS ELMOZDULÁSOK MÉRÉSE KAPACITÍV ÉS INDUKTÍV MÓDSZERREL 7. Laboratóriumi gyakorlat KIS ELMOZDULÁSOK MÉRÉSE KAPACITÍV ÉS INDUKTÍV MÓDSZERREL 1. A gyakorlat célja Kis elmozulások (.1mm 1cm) mérésének bemutatása egyszerű felépítésű érzékkőkkel. Kapacitív és inuktív

Részletesebben

Szabályozott tulajdonságokkal rendelkező mágneses nanokristályok biomimetikus szintézise

Szabályozott tulajdonságokkal rendelkező mágneses nanokristályok biomimetikus szintézise Szabályozott tulajdonságokkal rendelkező mágneses nanokristályok biomimetikus szintézise Pósfai Mihály Pannon Egyetem, Környezettudományi Intézet Kutató Kari Minősítés Kötelezettségei és Lehetőségei Veszprém,

Részletesebben

Műszeres analitika. Abrankó László. Molekulaspektroszkópia. Kémiai élelmiszervizsgálati módszerek csoportosítása

Műszeres analitika. Abrankó László. Molekulaspektroszkópia. Kémiai élelmiszervizsgálati módszerek csoportosítása Abrankó László Műszeres analitika Molekulaspektroszkópia Minőségi elemzés Kvalitatív Cél: Meghatározni, hogy egy adott mintában jelen vannak-e bizonyos ismert komponensek. Vagy ismeretlen komponensek azonosítása

Részletesebben

Az ipari komputer tomográfia vizsgálati lehetőségei

Az ipari komputer tomográfia vizsgálati lehetőségei Az ipari komputer tomográfia vizsgálati lehetőségei Dr. Czinege Imre, Kozma István Széchenyi István Egyetem 6. ANYAGVIZSGÁLAT A GYAKORLATBAN KONFERENCIA Cegléd, 2012. június 7-8. Tartalom A CT technika

Részletesebben

E (total) = E (translational) + E (rotation) + E (vibration) + E (electronic) + E (electronic

E (total) = E (translational) + E (rotation) + E (vibration) + E (electronic) + E (electronic Abszorpciós spektroszkópia Abszorpciós spektrofotometria 29.2.2. Az abszorpciós spektroszkópia a fényabszorpció jelenségét használja fel híg oldatok minőségi és mennyiségi vizsgálatára. Abszorpció Az elektromágneses

Részletesebben

9. Gyakorlat - Optoelektronikai áramköri elemek

9. Gyakorlat - Optoelektronikai áramköri elemek 9. Gyakorlat - Optoelektronikai áramköri elemek (Componente optoelectronice) (Optoelectronic devices) 1. Fénydiódák (LED-ek) Elnevezésük az angol Light Emitting Diode rövidítéséből származik. Áramköri

Részletesebben

Optikai méréstechnika alkalmazása járműipari mérésekben Kornis János

Optikai méréstechnika alkalmazása járműipari mérésekben Kornis János Optikai méréstechnika alkalmazása járműipari mérésekben Kornis János PhD, okleveles villamosmérnök, Budapesti Műszaki és Gazdaságtudományi Egyetem Fizika Tanszék, kornis@phy.bme.hu Absztrakt: Az optikai

Részletesebben

Digitális mérőműszerek

Digitális mérőműszerek KTE Szakmai nap, Tihany Digitális mérőműszerek Digitális jelek mérése Kaltenecker Zsolt KT-Electronic MIRŐL LESZ SZÓ? Mit mérjünk? Hogyan jelentkezik a minőségromlás digitális TV jel esetében? Milyen paraméterekkel

Részletesebben

MIKRO-TÜKÖR BUDAPEST UNIVERSITY OF TECHNOLOGY AND ECONOMICS DEPARTMENT OF ELECTRONICS TECHNOLOGY

MIKRO-TÜKÖR BUDAPEST UNIVERSITY OF TECHNOLOGY AND ECONOMICS DEPARTMENT OF ELECTRONICS TECHNOLOGY MIKRO-TÜKÖR BUDAPEST UNIVERSITY OF TECHNOLOGY AND ECONOMICS DEPARTMENT OF ELECTRONICS TECHNOLOGY TV Kiforrott technológia Kiváló képminőség Környezeti fény nem befolyásolja 4:3, 16:9 Max méret 100 cm Mélységi

Részletesebben

Szélesszögű spektroszkópiai ellipszométer fejlesztése és alkalmazása napelem-technológiai ZnO rétegek vizsgálatára

Szélesszögű spektroszkópiai ellipszométer fejlesztése és alkalmazása napelem-technológiai ZnO rétegek vizsgálatára Szélesszögű spektroszkópiai ellipszométer fejlesztése és alkalmazása napelem-technológiai ZnO rétegek vizsgálatára PhD tézisfüzet Major Csaba Ferenc Témavezető: Dr. Fried Miklós Magyar Tudományos Akadémia

Részletesebben

Modern Fizika Labor. Fizika BSc. Értékelés: A mérés dátuma: A mérés száma és címe: 5. mérés: Elektronspin rezonancia. 2008. március 18.

Modern Fizika Labor. Fizika BSc. Értékelés: A mérés dátuma: A mérés száma és címe: 5. mérés: Elektronspin rezonancia. 2008. március 18. Modern Fizika Labor Fizika BSc A mérés dátuma: 28. március 18. A mérés száma és címe: 5. mérés: Elektronspin rezonancia Értékelés: A beadás dátuma: 28. március 26. A mérést végezte: 1/7 A mérés leírása:

Részletesebben

Aktuátorok korszerű anyagai. Készítette: Tomozi György

Aktuátorok korszerű anyagai. Készítette: Tomozi György Aktuátorok korszerű anyagai Készítette: Tomozi György Technológiai fejlődés iránya Mikro nanotechnológia egyre kisebb aktuátorok egyre gyorsabb aktuátorok nem feltétlenül villamos, hanem egyéb csatolás

Részletesebben

2011.11.25. Modern Biofizikai Kutatási Módszerek 2011.11.03. Kereskedelmi forgalomban kapható készülékek. Áramlási citometria (flow cytometry)

2011.11.25. Modern Biofizikai Kutatási Módszerek 2011.11.03. Kereskedelmi forgalomban kapható készülékek. Áramlási citometria (flow cytometry) Modern Biofizikai Kutatási Módszerek 2011.11.03. Kereskedelmi forgalomban kapható készülékek Áramlási citometria (flow cytometry) Eljárás vagy mérési módszer, amellyel folyadékáramban lévő önálló részecskék,

Részletesebben

Mérés: Millikan olajcsepp-kísérlete

Mérés: Millikan olajcsepp-kísérlete Mérés: Millikan olajcsepp-kísérlete Mérés célja: 1909-ben ezt a mérést Robert Millikan végezte el először. Mérése során meg tudta határozni az elemi részecskék töltését. Ezért a felfedezéséért Nobel-díjat

Részletesebben

Távvezetéki szigetelők, szerelvények és sodronyok diagnosztikai módszerei és fejlesztések a KMOP-1.1.4-09-2010-0067 számú pályázat keretében Fogarasi

Távvezetéki szigetelők, szerelvények és sodronyok diagnosztikai módszerei és fejlesztések a KMOP-1.1.4-09-2010-0067 számú pályázat keretében Fogarasi Távvezetéki szigetelők, szerelvények és sodronyok diagnosztikai módszerei és fejlesztések a KMOP-1.1.4-09-2010-0067 számú pályázat keretében Fogarasi Tiborné - Dr. Varga László VILLENKI VEIKI VEIKI-VNL

Részletesebben

mintasepcifikus mikrokapilláris elektroforézis Lab-on-Chip elektroforézis / elektrokinetikus elven DNS, RNS, mirns 12, fehérje 10, sejtes minta 6

mintasepcifikus mikrokapilláris elektroforézis Lab-on-Chip elektroforézis / elektrokinetikus elven DNS, RNS, mirns 12, fehérje 10, sejtes minta 6 Agilent 2100 Bioanalyzer mikrokapilláris gélelektroforézis rendszer G2943CA 2100 Bioanalyzer system forgalmazó: Kromat Kft. 1112 Budapest Péterhegyi u. 98. t:36 (1) 248-2110 www.kromat.hu bio@kromat.hu

Részletesebben

2. Elméleti összefoglaló

2. Elméleti összefoglaló 2. Elméleti összefoglaló 2.1 A D/A konverterek [1] A D/A konverter feladata, hogy a bemenetére érkező egész számmal arányos analóg feszültséget vagy áramot állítson elő a kimenetén. A működéséhez szükséges

Részletesebben

Modern fizika laboratórium

Modern fizika laboratórium Modern fizika laboratórium Röntgen-fluoreszcencia analízis Készítette: Básti József és Hagymási Imre 1. Bevezetés A röntgen-fluoreszcencia analízis (RFA) egy roncsolásmentes anyagvizsgálati módszer. Rövid

Részletesebben

11.3. Az Achilles- ín egy olyan rugónak tekinthető, amelynek rugóállandója 3 10 5 N/m. Mekkora erő szükséges az ín 2 mm- rel történő megnyújtásához?

11.3. Az Achilles- ín egy olyan rugónak tekinthető, amelynek rugóállandója 3 10 5 N/m. Mekkora erő szükséges az ín 2 mm- rel történő megnyújtásához? Fényemisszió 2.45. Az elektromágneses spektrum látható tartománya a 400 és 800 nm- es hullámhosszak között található. Mely energiatartomány (ev- ban) felel meg ennek a hullámhossztartománynak? 2.56. A

Részletesebben

Ipari jelölő lézergépek alkalmazása a gyógyszer- és elektronikai iparban

Ipari jelölő lézergépek alkalmazása a gyógyszer- és elektronikai iparban Gyártás 08 konferenciára 2008. november 6-7. Ipari jelölő lézergépek alkalmazása a gyógyszer- és elektronikai iparban Szerző: Varga Bernadett, okl. gépészmérnök, III. PhD hallgató a BME VIK ET Tanszékén

Részletesebben

Szintetikus receptorokon és nanoszerkezeteken alapuló kémiai és bioszenzorok Gyurcsányi E. Róbert

Szintetikus receptorokon és nanoszerkezeteken alapuló kémiai és bioszenzorok Gyurcsányi E. Róbert Szintetikus receptorokon és nanoszerkezeteken alapuló kémiai és bioszenzorok Gyurcsányi E. Róbert Szervetlen és Analitikai Kémia Tanszék Budapesti Műszaki és Gazdaságtudományi Egyetem Érzékelés Minta Molekuláris

Részletesebben

Ultrahangos anyagvizsgálati módszerek atomerőművekben

Ultrahangos anyagvizsgálati módszerek atomerőművekben Ultrahangos anyagvizsgálati módszerek atomerőművekben Hangfrekvencia 20 000 000 Hz 20 MHz 2 000 000 Hz 20 000 Hz 20 Hz anyagvizsgálatok esetén használt UH ultrahang hallható hang infrahang 2 MHz 20 khz

Részletesebben

Digitális mérőműszerek. Kaltenecker Zsolt Hiradástechnikai Villamosmérnök Szinusz Hullám Bt.

Digitális mérőműszerek. Kaltenecker Zsolt Hiradástechnikai Villamosmérnök Szinusz Hullám Bt. Digitális mérőműszerek Digitális jelek mérése Kaltenecker Zsolt Hiradástechnikai Villamosmérnök Szinusz Hullám Bt. MIRŐL LESZ SZÓ? Mit mérjünk? Hogyan jelentkezik a minőségromlás digitális jel esetében?

Részletesebben

ALKÍMIA MA Az anyagról mai szemmel, a régiek megszállottságával. www.chem.elte.hu/pr

ALKÍMIA MA Az anyagról mai szemmel, a régiek megszállottságával. www.chem.elte.hu/pr ALKÍMIA MA Az anyagról mai szemmel, a régiek megszállottságával www.chem.elte.hu/pr Kvíz az előző előadáshoz 1) Mikor kapott Paul Ehrlich orvosi Nobel-díjat? A) Idén. B) Pont 100 éve, 1908-ban. C) Nem

Részletesebben

Fényvezető szálak és optikai kábelek

Fényvezető szálak és optikai kábelek Fényvezető szálak és optikai kábelek Fizikai alapok A fénytávközlés alapvető passzív elemei. Ötlet: 1880-as években Alexander Graham Bell. Optikai szálak felhasználásának kezdete: 1960- as évek. Áttörés

Részletesebben

Koherens lézerspektroszkópia adalékolt optikai egykristályokban

Koherens lézerspektroszkópia adalékolt optikai egykristályokban Koherens lézerspektroszkópia adalékolt optikai egykristályokban Kis Zsolt MTA Wigner Fizikai Kutatóközpont H-1121 Budapest, Konkoly-Thege Miklós út 29-33 2015. június 8. Hogyan nyerjünk információt egyes

Részletesebben

Fény, mint elektromágneses hullám, geometriai optika

Fény, mint elektromágneses hullám, geometriai optika Fény, mint elektromágneses hullám, geometriai optika Az elektromágneses hullámok egyik fajtája a szemünk által látható fény. Látható fény (400 nm 800 nm) (vörös ibolyakék) A látható fehér fény a különböző

Részletesebben

Az ellenanyagok orvosbiológiai. PhD kurzus 2011/2012 II. félév

Az ellenanyagok orvosbiológiai. PhD kurzus 2011/2012 II. félév Az ellenanyagok orvosbiológiai alkalmazása PhD kurzus 2011/2012 II. félév Ellenanyaggal működő módszerek Analitikai felhasználás Analitikai felhasználás Ellenanyag / antigén kapcsolódás Az Ab/Ag kapcsolat

Részletesebben

Sugárzáson, és infravörös sugárzáson alapuló hőmérséklet mérés.

Sugárzáson, és infravörös sugárzáson alapuló hőmérséklet mérés. Sugárzáson, és infravörös sugárzáson alapuló hőmérséklet mérés. A sugárzáson alapuló hőmérsékletmérés (termográfia),azt a fizikai jelenséget használja fel, hogy az abszolút nulla K hőmérséklet (273,16

Részletesebben

Távérzékelés, a jöv ígéretes eszköze

Távérzékelés, a jöv ígéretes eszköze Távérzékelés, a jöv ígéretes eszköze Ritvayné Szomolányi Mária Frombach Gabriella VITUKI CONSULT Zrt. A távérzékelés segítségével: különböz6 magasságból, tetsz6leges id6ben és a kívánt hullámhossz tartományokban

Részletesebben

ELEKTROMÁGNESES REZGÉSEK. a 11. B-nek

ELEKTROMÁGNESES REZGÉSEK. a 11. B-nek ELEKTROMÁGNESES REZGÉSEK a 11. B-nek Elektromos Kondenzátor: töltés tárolására szolgáló eszköz (szó szerint összesűrít) Kapacitás (C): hány töltés fér el rajta 1 V-on A homogén elektromos mező energiát

Részletesebben

A levegő törésmutatójának mérése Michelsoninterferométerrel

A levegő törésmutatójának mérése Michelsoninterferométerrel XI. Erdélyi Tudományos Diákköri Konferencia Kolozsvár, 008. május 3 4. A levegő törésmutatójának mérése Michelsoninterferométerrel Szerző: Kovács Anikó-Zsuzsa, Babes-Bolyai Tudoányegyetem Kolozsvár, Fizika

Részletesebben

A centriólum és a sejtek mozgási organellumai

A centriólum és a sejtek mozgási organellumai A centriólum A centriólum és a sejtek mozgási organellumai Egysejtű eukarióta sejtekben,soksejtű állatok sejtjeiben 9x3-triplet A,B és C tubulus alegységek hengerpalástszerű helyezkedéssel Hossza 0,3mm

Részletesebben

Alkalmazás a makrókanónikus sokaságra: A fotongáz

Alkalmazás a makrókanónikus sokaságra: A fotongáz Alkalmazás a makrókanónikus sokaságra: A fotongáz A fotonok az elektromágneses sugárzás hordozó részecskéi. Spinkvantumszámuk S=, tehát kvantumstatisztikai szempontból bozonok. Fotonoknak habár a spinkvantumszámuk,

Részletesebben

KISFESZÜLTSÉGŰ KÁBELEK

KISFESZÜLTSÉGŰ KÁBELEK BME Villamos Energetika Tanszék Nagyfeszültségű Technika és Berendezések Csoport Budapesti Műszaki és Gazdaságtudományi Egyetem KISFESZÜLTSÉGŰ KÁBELEK DIAGNOSZTIKÁJA TELJES FESZÜLTSÉGVÁLASZ MÓDSZERREL

Részletesebben

ESR-spektrumok különbözı kísérleti körülmények között A számítógépes értékelés alapjai anizotróp kölcsönhatási tenzorok esetén

ESR-spektrumok különbözı kísérleti körülmények között A számítógépes értékelés alapjai anizotróp kölcsönhatási tenzorok esetén ESR-spektrumok különbözı kísérleti körülmények között A számítógépes értékelés alapjai anizotróp kölcsönhatási tenzorok esetén A paraméterek anizotrópiája egykristályok rögzített tengely körüli forgatásakor

Részletesebben

Adatgyőjtés, mérési alapok, a környezetgazdálkodás fontosabb mőszerei

Adatgyőjtés, mérési alapok, a környezetgazdálkodás fontosabb mőszerei GazdálkodásimodulGazdaságtudományismeretekI.Közgazdaságtan KÖRNYEZETGAZDÁLKODÁSIMÉRNÖKIMScTERMÉSZETVÉDELMIMÉRNÖKIMSc Tudományos kutatásmódszertani, elemzési és közlési ismeretek modul Adatgyőjtés, mérési

Részletesebben

3. Laboratóriumi gyakorlat A HŐELLENÁLLÁS

3. Laboratóriumi gyakorlat A HŐELLENÁLLÁS 3. Laboratóriumi gyakorlat A HŐELLENÁLLÁS 1. A gyakorlat célja A Platina100 hőellenállás tanulmányozása kiegyensúlyozott és kiegyensúlyozatlan Wheatstone híd segítségével. Az érzékelő ellenállásának mérése

Részletesebben

OPTIKA. Vozáry Eszter November

OPTIKA. Vozáry Eszter November OPTIKA Vozáry Eszter 2015. November FÉNY Energia: elektromágneses hullám c = λf részecske foton ε = hf Szubjektív érzet látás fény és színérzékelés ELEKTROMÁGNESES SPEKTRUM c = λf ε = hf FÉNY TRANSZVERZÁLIS

Részletesebben

Kábeldiagnosztikai vizsgálatok a BME-n

Kábeldiagnosztikai vizsgálatok a BME-n Budapesti i Műszaki és Gazdaságtudományi Egyetem Kábeldiagnosztikai vizsgálatok a BME-n Tamus Zoltán Ádám tamus.adam@vet.bme.hu TARTALOM Szigetelőanyagok öregedése Kábelek öregedése Szigetelésdiagnosztika

Részletesebben

A II. kategória Fizika OKTV mérési feladatainak megoldása

A II. kategória Fizika OKTV mérési feladatainak megoldása Nyomaték (x 0 Nm) O k t a t á si Hivatal A II. kategória Fizika OKTV mérési feladatainak megoldása./ A mágnes-gyűrűket a feladatban meghatározott sorrendbe és helyre rögzítve az alábbi táblázatban feltüntetett

Részletesebben

Kontrol kártyák használata a laboratóriumi gyakorlatban

Kontrol kártyák használata a laboratóriumi gyakorlatban Kontrol kártyák használata a laboratóriumi gyakorlatban Rikker Tamás tudományos igazgató WESSLING Közhasznú Nonprofit Kft. 2013. január 17. Kis történelem 1920-as években, a Bell Laboratórium telefonjainak

Részletesebben

2.9.1. TABLETTÁK ÉS KAPSZULÁK SZÉTESÉSE

2.9.1. TABLETTÁK ÉS KAPSZULÁK SZÉTESÉSE 2.9.1 Tabletták és kapszulák szétesése Ph.Hg.VIII. Ph.Eur.6.3-1 01/2009:20901 2.9.1. TABLETTÁK ÉS KAPSZULÁK SZÉTESÉSE A szétesésvizsgálattal azt határozzuk meg, hogy az alábbiakban leírt kísérleti körülmények

Részletesebben

12/4/2014. Genetika 7-8 ea. DNS szerkezete, replikáció és a rekombináció. 1952 Hershey & Chase 1953!!!

12/4/2014. Genetika 7-8 ea. DNS szerkezete, replikáció és a rekombináció. 1952 Hershey & Chase 1953!!! Genetika 7-8 ea. DNS szerkezete, replikáció és a rekombináció 1859 1865 1869 1952 Hershey & Chase 1953!!! 1879 1903 1951 1950 1944 1928 1911 1 1. DNS szerkezete Mi az örökítő anyag? Friedrich Miescher

Részletesebben

Több komponensű brikettek: a még hatékonyabb hulladékhasznosítás egy új lehetősége

Több komponensű brikettek: a még hatékonyabb hulladékhasznosítás egy új lehetősége Több komponensű brikettek: a még hatékonyabb hulladékhasznosítás egy új lehetősége Készítette: az EVEN-PUB Kft. 2014.04.30. Projekt azonosító: DAOP-1.3.1-12-2012-0012 A projekt motivációja: A hazai brikett

Részletesebben

9. Laboratóriumi gyakorlat NYOMÁSÉRZÉKELŐK

9. Laboratóriumi gyakorlat NYOMÁSÉRZÉKELŐK 9. Laboratóriumi gyakorlat NYOMÁSÉRZÉKELŐK 1.A gyakorlat célja Az MPX12DP piezorezisztiv differenciális nyomásérzékelő tanulmányozása. A nyomás feszültség p=f(u) karakterisztika megrajzolása. 2. Elméleti

Részletesebben

1.1 Emisszió, reflexió, transzmisszió

1.1 Emisszió, reflexió, transzmisszió 1.1 Emisszió, reflexió, transzmisszió A hőkamera által észlelt hosszú hullámú sugárzás - amit a hőkamera a látómezejében érzékel - a felület emissziójának, reflexiójának és transzmissziójának függvénye.

Részletesebben

A vizsgált anyag ellenállása az adott geometriájú szúrószerszám behatolásával szemben, Mérnöki alapismeretek és biztonságtechnika

A vizsgált anyag ellenállása az adott geometriájú szúrószerszám behatolásával szemben, Mérnöki alapismeretek és biztonságtechnika Dunaújvárosi Főiskola Anyagtudományi és Gépészeti Intézet Mérnöki alapismeretek és biztonságtechnika Mechanikai anyagvizsgálat 2. Dr. Palotás Béla palotasb@mail.duf.hu Készült: Dr. Krállics György (BME,

Részletesebben

Adatgyűjtés, mérési alapok, a környezetgazdálkodás fontosabb műszerei

Adatgyűjtés, mérési alapok, a környezetgazdálkodás fontosabb műszerei Tudományos kutatásmódszertani, elemzési és közlési ismeretek modul Gazdálkodási modul Gazdaságtudományi ismeretek I. Közgazdasá Adatgyűjtés, mérési alapok, a környezetgazdálkodás fontosabb műszerei KÖRNYEZETGAZDÁLKODÁSI

Részletesebben

TRANSZPORTFOLYAMATOK A SEJTEKBEN

TRANSZPORTFOLYAMATOK A SEJTEKBEN 16 A sejtek felépítése és mûködése TRANSZPORTFOLYAMATOK A SEJTEKBEN 1. Sejtmembrán elektronmikroszkópos felvétele mitokondrium (energiatermelõ és lebontó folyamatok) citoplazma (fehérjeszintézis, anyag

Részletesebben

Világító diódák emissziójának szimulációja Monte Carlo sugárkövetés módszerével

Világító diódák emissziójának szimulációja Monte Carlo sugárkövetés módszerével Világító diódák emissziójának szimulációja Monte Carlo sugárkövetés módszerével Borbély Ákos, Steve G. Johnson Lawrence Berkeley National Laboratory, CA e-mail: ABorbely@lbl.gov Az előadás vázlata Nagy

Részletesebben

N I. 02 B. Mágneses anyagvizsgálat G ép. 118 2011.11.30. A mérés dátuma: A mérés eszközei: A mérés menetének leírása:

N I. 02 B. Mágneses anyagvizsgálat G ép. 118 2011.11.30. A mérés dátuma: A mérés eszközei: A mérés menetének leírása: N I. 02 B A mérés eszközei: Számítógép Gerjesztésszabályzó toroid transzformátor Minták Mágneses anyagvizsgálat G ép. 118 A mérés menetének leírása: Beindítottuk a számtógépet, Behelyeztük a mintát a ferrotestbe.

Részletesebben

Modern Fizika Laboratórium Fizika és Matematika BSc 14. Holográfia

Modern Fizika Laboratórium Fizika és Matematika BSc 14. Holográfia Modern Fizika Laboratórium Fizika és Matematika BSc 14. Holográfia Mérést végezték: Bodó Ágnes Márkus Bence Gábor Kedd délelőtti csoport Mérés ideje: 03/06/2012 Beadás ideje: 05/22/2012 (javítás) Érdemjegy:

Részletesebben

Kábelszerelvények akusztikus. tapasztalatai. e-mail: cselko.richard@vet.bme.hu. Budapesti Műszaki M. gtudományi Egyetem

Kábelszerelvények akusztikus. tapasztalatai. e-mail: cselko.richard@vet.bme.hu. Budapesti Műszaki M. gtudományi Egyetem Budapesti Műszaki M és s Gazdaságtudom gtudományi Egyetem Kábelszerelvények akusztikus részkisülés s vizsgálat latának tapasztalatai Cselkó Richárd rd,, Tamus Zoltán Ádám, Szabó Attila e-mail: cselko.richard@vet.bme.hu

Részletesebben

Sejtmozgás és adhézió Molekuláris biológia kurzus 8. hét. Kun Lídia Genetikai, Sejt és Immunbiológiai Intézet

Sejtmozgás és adhézió Molekuláris biológia kurzus 8. hét. Kun Lídia Genetikai, Sejt és Immunbiológiai Intézet Sejtmozgás és adhézió Molekuláris biológia kurzus 8. hét Kun Lídia Genetikai, Sejt és Immunbiológiai Intézet Sejtmozgás -amőboid - csillós - kontrakció Sejt adhézió -sejt-ecm -sejt-sejt MOZGÁS A sejtmozgás

Részletesebben

Mit nevezünk nehézségi erőnek?

Mit nevezünk nehézségi erőnek? Mit nevezünk nehézségi erőnek? Azt az erőt, amelynek hatására a szabadon eső testek g (gravitációs) gyorsulással esnek a vonzó test centruma felé, nevezzük nehézségi erőnek. F neh = m g Mi a súly? Azt

Részletesebben

HULLADÉKCSÖKKENTÉS. EEA Grants Norway Grants. Élelmiszeripari zöld innovációs program megvalósítása. Dr. Nagy Attila, Debreceni Egyetem 2014.10.28.

HULLADÉKCSÖKKENTÉS. EEA Grants Norway Grants. Élelmiszeripari zöld innovációs program megvalósítása. Dr. Nagy Attila, Debreceni Egyetem 2014.10.28. Élelmiszeripari zöld innovációs program megvalósítása EEA Grants Norway Grants HULLADÉKCSÖKKENTÉS Dr. Nagy Attila, Debreceni Egyetem HU09-0015-A1-2013 1 Beruházás oka A vágóhidakról kikerülő baromfi nyesedék

Részletesebben

Jegyzőkönyv. hangfrekvenciás mechanikai rezgések vizsgálatáról (3)

Jegyzőkönyv. hangfrekvenciás mechanikai rezgések vizsgálatáról (3) Jegyzőkönyv a hangfrekvenciás mechanikai rezgések vizsgálatáról () Készítette: Tüzes Dániel Mérés ideje: 2008-11-19, szerda 14-18 óra Jegyzőkönyv elkészülte: 2008-11-26 A mérés célja A feladat két anyag

Részletesebben

Áramköri elemek. 1 Ábra: Az ellenállások egyezményes jele

Áramköri elemek. 1 Ábra: Az ellenállások egyezményes jele Áramköri elemek Az elektronikai áramkörök áramköri elemekből épülnek fel. Az áramköri elemeket két osztályba sorolhatjuk: aktív áramköri elemek: T passzív áramköri elemek: R, C, L Aktív áramköri elemek

Részletesebben

Elektrotechnika. Ballagi Áron

Elektrotechnika. Ballagi Áron Elektrotechnika Ballagi Áron Mágneses tér Elektrotechnika x/2 Mágneses indukció kísérlet Állandó mágneses térben helyezzünk el egy l hosszúságú vezetőt, és bocsássunk a vezetőbe I áramot! Tapasztalat:

Részletesebben

HULLÁMPAPÍRLEMEZHEZ HASZNÁLT ALAPPAPÍROK TÍPUSÁNAK AZONOSÍTÁSA KÉMIAI ANALITIKAI MÓDSZERREL. Előadó: Tóth Barnabás és Kalász Ádám

HULLÁMPAPÍRLEMEZHEZ HASZNÁLT ALAPPAPÍROK TÍPUSÁNAK AZONOSÍTÁSA KÉMIAI ANALITIKAI MÓDSZERREL. Előadó: Tóth Barnabás és Kalász Ádám HULLÁMPAPÍRLEMEZHEZ HASZNÁLT ALAPPAPÍROK TÍPUSÁNAK AZONOSÍTÁSA KÉMIAI ANALITIKAI MÓDSZERREL Tóth Barnabás és Kalász Ádám 1 Hullámpapírlemez alkalmazási területe Hullámpapír csomagolás az ipar szinte valamennyi

Részletesebben

Jegyzőkönyv. mágneses szuszceptibilitás méréséről (7)

Jegyzőkönyv. mágneses szuszceptibilitás méréséről (7) Jegyzőkönyv a mágneses szuszceptibilitás méréséről (7) Készítette: Tüzes Dániel Mérés ideje: 8-1-1, szerda 14-18 óra Jegyzőkönyv elkészülte: 8-1-8 A mérés célja A feladat egy mágneses térerősségmérő eszköz

Részletesebben

Biomolekuláris kölcsönhatások vizsgálata felületi plazmonrezonancia elvén működő Biacore keszülékkel

Biomolekuláris kölcsönhatások vizsgálata felületi plazmonrezonancia elvén működő Biacore keszülékkel Biomolekuláris kölcsönhatások vizsgálata felületi plazmonrezonancia elvén működő Biacore keszülékkel Biomolekuláris interakciók Fehérje-fehérje Fehérje-ligand Fehérje-DNS/RNS fehérje/ligand-lipid Alegység-kölcsönhatások,

Részletesebben

Jegyzetelési segédlet 8.

Jegyzetelési segédlet 8. Jegyzetelési segédlet 8. Informatikai rendszerelemek tárgyhoz 2009 Szerkesztett változat Géczy László Billentyűzet, billentyűk szabványos elrendezése funkció billentyűk ISO nemzetközi írógép alap billentyűk

Részletesebben

Fénytechnika. A szem, a látás és a színes látás. Dr. Wenzel Klára. egyetemi magántanár Budapesti Műszaki és Gazdaságtudományi Egyetem

Fénytechnika. A szem, a látás és a színes látás. Dr. Wenzel Klára. egyetemi magántanár Budapesti Műszaki és Gazdaságtudományi Egyetem Fénytechnika A szem, a látás és a színes látás Dr. Wenzel Klára egyetemi magántanár Budapesti Műszaki és Gazdaságtudományi Egyetem Budapest, 2013 Mi a szín? (MSz 9620) Fizika: a szín meghatározott hullámhosszúságú

Részletesebben

MÁGNESES TÉR, INDUKCIÓ

MÁGNESES TÉR, INDUKCIÓ Egy vezetéket 2 cm átmérőjű szigetelő testre 500 menettel tekercselünk fel, 25 cm hosszúságban. Mekkora térerősség lép fel a tekercs belsejében, ha a vezetékben 5 amperes áram folyik? Mekkora a mágneses

Részletesebben

Mérési metodika és a műszer bemutatása

Mérési metodika és a műszer bemutatása Mérési metodika és a műszer bemutatása CPT kábelnélküli rendszer felépítése A Cone Penetration Test (kúpbehatolási vizsgálat), röviden CPT, egy olyan talajvizsgálati módszer, amely segítségével pontos

Részletesebben

1. ERŐMÉRÉS NYÚLÁSMÉRŐ BÉLYEG ALKALMAZÁSÁVAL

1. ERŐMÉRÉS NYÚLÁSMÉRŐ BÉLYEG ALKALMAZÁSÁVAL 1. ERŐMÉRÉS NYÚLÁSMÉRŐ BÉLYEG LKLMZÁSÁVL nyúlásmérő bélyegek mechanikai deformációt alakítanak át ellenállás-változássá. lkalmazásukkal úgy készítenek erőmérő cellát, hogy egy rugalmas alakváltozást szenvedő

Részletesebben

MATROSHKA kísérletek a Nemzetközi Űrállomáson. Kató Zoltán, Pálfalvi József

MATROSHKA kísérletek a Nemzetközi Űrállomáson. Kató Zoltán, Pálfalvi József MATROSHKA kísérletek a Nemzetközi Űrállomáson Kató Zoltán, Pálfalvi József Sugárvédelmi Továbbképző Tanfolyam Hajdúszoboszló 2010 A Matroshka kísérletek: Az Európai Űrügynökség (ESA) dozimetriai programjának

Részletesebben

A projekt rövidítve: NANOSTER A projekt időtartama: 2009. október 2012. december

A projekt rövidítve: NANOSTER A projekt időtartama: 2009. október 2012. december A projekt címe: Egészségre ártalmatlan sterilizáló rendszer kifejlesztése A projekt rövidítve: NANOSTER A projekt időtartama: 2009. október 2012. december A konzorcium vezetője: A konzorcium tagjai: A

Részletesebben

mágneses-optikai Kerr effektus

mágneses-optikai Kerr effektus Mágnesezettség optikai úton történő detektálása: mágneses-optikai Kerr effektus I. Mágneses-optikai effektusok 2 II. Kísérleti technika 3 III. Mérési feladatok 5 IV. Ajánlott irodalom 6 2008. BME Fizika

Részletesebben

Polimerek fizikai, mechanikai, termikus tulajdonságai

Polimerek fizikai, mechanikai, termikus tulajdonságai SZÉCHENYI ISTVÁN EGYETEM ANYAGISMERETI ÉS JÁRMŰGYÁRTÁSI TANSZÉK POLIMERTECHNIKA NGB_AJ050_1 Polimerek fizikai, mechanikai, termikus tulajdonságai DR Hargitai Hajnalka 2011.10.05. BURGERS FÉLE NÉGYPARAMÉTERES

Részletesebben