A BIOTECHNOLÓGIA MÛSZAKI HÁTTERE

Átírás

1 A BIOTECHNOLÓGIA MÛSZAKI HÁTTERE A kvantitatív polimeráz láncreakció (Q-PCR) alkalmazása biotechnológiai termékek biztonságának és genetikai stabilitásának vizsgálatában Tárgyszavak: kvantitatív polimeráz láncreakció; biobiztonság; genetikai stabilitás. A kvantitatív polimeráz láncreakcióról A nagy teljesítményű kvantitatív polimeráz láncreakció (Q-PCR) valósággal forradalmasította a nukleinsavak és a retrovírus eredetű reverz transzkriptáz enzimek valós idejű kimutatását. Az eljárást sokoldalúan alkalmazzák a gyógyászati anyagok és eljárások fejlesztésénél, többek között génexpresszió, másolatszám-meghatározás, gén- vagy sejtterápia biológiai megoszlása vizsgálatánál vagy fertőzések kimutatásánál. Q-PCR vizsgálatok elvégezhetők pl. ABI PRISM TM típusú szekvenciadetektorral (7700, 7900HT vagy 5700 típusú készülékkel). Ennek a berendezésnek a segítségével pontosan és mennyiségileg meghatározható egy adott DNS- vagy RNS-szekvencia mennyisége szövetextraktumokból, végtermékekből, sejtbankokból, kromatográfiás elutáumokból vagy begyűjtött biomaszszából. A láncreakciós erősítés (amplifikáció) során egy fluoreszcens aktivitású jelző (reporter) festékkel (FAM, VIC, TET, JOE vagy HEX), valamint kioltó (quencher) festékkel (TAMRA) ellátott oligonukleotid próba kapcsolódik hozzá az erősítés során a felerősített termékhez. A detektálási reakció során az AmpliTaq Gold TM DNS-polimeráz -exonukleáz-aktivitását használják ki a jelzőmolekula leválasztásához, aminek hatására a célszekvencia jelenlétében megnő a fluoreszcencia (1/a ábra). A szekvencia-detektor kiszámítja a jelzőfestékre vonatkozó R n értéket minden egyes mintára, minden erősítési ciklusban. A normalizált reporterszignál (R n értéke) a jelzőfesték viszonylagos fluoreszcenciás intenzitását mutatja, osztva egy passzív referenciafestékre vonatkozó értékkel. A PCR során az R n -érték nő, ahogy az amplikonok kópiaszáma nő, amíg a reakció el nem éri a telítési értéket. A R n értéket úgy kapják, hogy az R n -értékből levonják a jelzőfestéknek az első néhány PCR ciklusban mérhető fluoreszcenciás intenzitását. A R n -érték ugyancsak nő a PCR ciklusok számával, amíg el nem éri a telítési értéket (1/b ábra). A küszöb ciklus (C T )

2 értéket valós időben számítják ki, és ez azzal a PCR ciklusszámmal egyezik meg, amelynél a jelzőfesték fluoreszcencia-értéke először az alapszint fölé emelkedik (1/b ábra). A C T -érték és a kiindulási mennyiség közti lineáris összefüggés kalibrációs görbe készítését teszi lehetővé. A kiindulási kópiák számának logaritmusával arányosan csökken a C T -érték. (a) polimerizáció R = jelző Q = kioltó előrehaladó primer próba reverz primer a szál elmozdulása hasítás a teljes polimerizáció elérése után 1/a ábra A FAM jelzőfesték lehasadása a TaqMan próbáról a PCR erősítés során

3 (b) normalizált flueroszcenciás intenzitás küszöbérték alapvonal minta C r nincs templát-kontroll ciklusszám (b) az erősítési diagram, amely a FAM jelzőfesték fluoreszcenciás intenzitásának exponenciális növekedését és a C T érték kiszámításának módját mutatja 1. ábra Az -exonukleáz próba és a valós idejű Q-PCR erősítési módszer működési elve A valós idejű Q-PCR vizsgálatnak sok előnye van a végpontjelzéses PCR módszerrel szemben. A valós idejű Q-PCR vizsgálatot zárt reaktorban végzik, ami szükségtelenné teszi a PCR termékek utólagos feldolgozását. Ez nemcsak a módszer termelékenységét növeli, hanem csökkenti a szennyeződés átvitelének valószínűségét is. Az itt említett Q-PCR rendszer egyébként tartalmaz egy amplikonszennyeződést kiküszöbölő vegyi rendszert, és a Q-PCR vizsgálatokat a hagyományos PCR-hez hasonlóan úgy kell vezetni, hogy minden reakció elkülönített légtérben menjen végbe, mert ezzel is csökkenthető a keresztszennyeződések veszélye. A valós idejű Q-PCR vizsgálatok nagyobb teljesítménye azt is jelenti, hogy segítségével viszonylag könnyen nagy érzékenység érhető el. A reakciók többszörös ismétlésével a detektálási limit alatti vírusmennyiségek is könynyen kimutathatók. A valós idejű Q-PCR összekapcsolása automatikus extrakcióval és PCR berendezésekkel tovább növeli a módszer teljesítőképességét és csökkenti az emberi hiba veszélyét. A C T -érték a végpontnál kevésbé érzékeny az inhibitorokra is. A Q-PCR a hagyományos PCR módszerrel szemben lehetővé teszi a folyamatos vizsgálati módszerek fejlesztését, megbízható eredményeket és

4 nagy dinamikus tartományt biztosít. Ha a minta vírusszennyezett, a kiindulási DNS mennyisége adott, és eldönthető, hogy szükség van-e további beavatkozásra. Módszerfejlesztés és validálás A primer kiválasztása, optimálása és specificitása A Q-PCR módszer egyik első lépése a nukleinsav célszekvencia azonosítása DNS-adatbankok segítségével. Ezzel előre meg lehet becsülni annak a valószínűségét, hogy felléphetnek-e zavaró keresztreakciók más rokon szekvenciákkal, amelyek valószínűleg ugyancsak jelen vannak a mintában. A primer specificitása alapvető jelentőségű pl. kórokozók kimutatásánál, mert bár a hibás jelzések ritkák, nagy kárt okozhatnak pl. biotechnológiai termékek klinikai vizsgálatánál. A validálás lényeges lépése tehát a specificitás meghatározása. A vizsgálatnak különbséget kell tudnia tenni a célnukleinsav és egyéb, a mintában várhatóan előforduló nukleinsavak között. Olyan vírusok esetében, mint pl. a HIV-vírus vagy más vírusok, amelyek jelentős változékonyságot mutatnak, nagyon fontos, hogy a primer és a próbamolekulákat a vírusgenom állandó részéről válasszák. Ilyen módon kórokozók viszonylag széles körét lehet egyszerre detektálni. A megbízhatóság érdekében a próbát optimálni és validálni kell az ICH irányelvei alapján. A specificitási, linearitási vizsgálatokat, a kimutathatósági határ, a pontosság és az ismételhetőség meghatározását legalább két személynek kell elvégeznie, a méréseket legalább öt különböző koncentrációban, legalább egyszer mindkét személynek el kell végeznie. Ennek elmaradása komoly hibákat okozhat (pl. a túl magas háttér csökkenti a módszer érzékenységét). A primer optimálását több primerkoncentráció mellett végzik adott próbaés céltemplát-koncentráció mellett. Mivel a nagy R n értékek magas amplifikációs termék mennyiséget és hatékony reakciót jeleznek, olyan reverz primereket alkalmaznak, amelyek mellett a R n érték maximális. A próba optimálását az optimalizált primerkoncentráció mellett végzik el úgy, hogy a próba koncentrációját változtatják. Optimálisként a legkisebb C T -értéket eredményező próba koncentrációját fogadják el, mert ez jelzi a leghatékonyabb reakciókörülményeket. Linearitás, kimutathatósági határ, pontosság és ismételhetőség A fenti paramétereket nyolc reakcióval határozzák meg, öt különböző koncentráció mellett. A reprodukálhatóságot a korrelációs együttható (r 2 ), a tengelymetszet és a meredekség meghatározásával állapítják meg. P = 0,05 szignifikancia-szint mellett a minimális elfogadható r 2 érték 0,88, de általában 0,9-nél nagyobb értékek mérhetők.

5 A valós idejű Q-PCR mérések kimutatási határának megállapításánál biológiai eredetű minták esetében két akadály van: (1) a cél nukleinsav molekulák száma a fertőzött sejtekben, klinikai mintákban vagy elektronmikroszkóppal számlált vírustenyészetekben változhat; (2) lehet, hogy a célorganizmus szaporítására nincs elérhető tenyésztési módszer. Ezért a kimutathatósági határt először tisztított célmolekulák segítségével kell validálni rekombináns plazmid-dns vagy rekombináns RNS formájában. A kimutathatósági határ megállapításánál nyolc párhuzamos mérésnél minden esetben pozitív reakciót kell kapni, és a C T -értéknek 40-nél kisebbnek kell lennie. Általában nukleinsav-másolat rutinszerűen kimutatható celluláris genom mellett (DNS célmolekulák esetében) vagy 100 ng celluláris RNS mellett (RNS célmolekulák esetében). A leghasználhatóbb határértéket úgy állapítják meg, hogy 12 hónapon keresztül különböző reagensszállítmányokkal és különböző mérőszemélyzettel állapítják meg 95%-os megbízhatósági szint mellett a kimutathatósági határt és ebből a legnagyobbat fogadják el. A nukleinsav-extrakció validálása A vírusnukleinsavakat számos diagnosztikai és kutatólaboratóriumban rutinszerűen extrahálják. Az extrakció hatásfoka azonban függ magának a nukleinsavnak és a biológiai mátrixnak a jellegétől. Ezért adott nukleinsav kimutatásakor be kell bizonyítani, hogy az adott módszer alkalmazható a megfelelő nukleinsav és biológiai mátrix esetében. Mivel a Q-PCR módszer segítségével a nukleinsav-molekulák mennyisége kvantitatíven megállapítható, ezt a módszert fel lehet használni az extrakciós hatásfok megállapításához (példák az 1. táblázatban). Az extrakciós hatásfok megállapítása után meg kell határozni a PCR inhibíció mértékét is, hogy megkapják a korrigált kópiaszámot a kiindulási mintában. Ez úgy is megoldható, hogy pl. adott mintához ismert mennyiségű célmolekulát adnak és újra mérik az eredményt. Erre különösen akkor van szükség, ha sokféle biológiai mátrixot vizsgálnak, amelyek eltérő mennyiségű inhibitort tartalmazhatnak. Ha nem sejtekből, hanem pl. késztermékekből extrahálnak nukleinsavakat, célszerű hordozó molekulákat használni, mert ezek segítségével lehet a legjobb hatásfokkal kivonni a kis mennyiségben jelen lévő nukleinsavat. Ez pl. akkor szükséges, ha azt vizsgálják, hogy adott vakcinák milyen mértékben szennyezik a gazdasejt DNS-ét. Az 1. táblázat adataiból látható, hogy humán sejtvonalon mintegy 22%-os extrakciós hatásfokot lehetett elérni sejt-dns esetében, és hasonló értékeket mértek főemlős-, rágcsáló-, csirke- és sertéssejtek esetében is. A PCR-t inhibeáló anyagokkal leginkább akkor lehet találkozni, ha vírusvagy plazmidnukleinsavat akarnak extrahálni állati szövetekből vagy szekrétumokból. Az olyan anyagok, mint a heparin, karbamid, hemoglobin, izopropanol vagy etanol gátolják a PCR-t és rontják az extrakció hatásfokát is ezért módszereket kell kidolgozni eltávolításukra. Az ilyen vizsgálatokban

6 meg kell határozni azt a mintamennyiséget, amelyből kópia biztonsággal kinyerhető (2. táblázat). 1. táblázat Vírus- és sejt-nukleinsav extrakciós hatásfoka Quiagen-módszer használata mellett DNS vagy RNS Kinyerés BVDV 1000 RNS-kópia 11% Enterovírus ( TCID 50 ) 14% MLV 100 kópia 41% Sertés CMV 549 kópia 43% Poliómavírus 5000 kópia 40% HPV-18 DNS 1000 kópia 87% Gazdasejt DNS 78 pg 0,5 ml terápiás dózisban 22% 2. táblázat kópia vírus-nukleinsav kinyerésének hatásfoka 100 mg állati szövetből Qiagen DNS mini kit segítségével Állati szövet Kinyerés hatásfoka Agy 60 90% Vese 70 95% Lép 68 80% Tüdő 50 75% Ivarmirigyek 60 90% Izom 10 40% Vér 10 20% Szív % Nyirokcsomó 30 90% Máj 65 90% Adatfeldolgozás A ciklusok elvégzése után az eredményeket valós időskálán kiértékelik és minden mintára megállapítják a C T -értékeket, azok szórását és megbízhatósági intervallumát. Még ha pozitív az eredmény, akkor is előfordulhat, hogy azt egy előzőleg fel nem ismert, homológ szerkezetű DNS okozta. Pozitív eredményről tehát csak akkor lehet beszélni, ha két független amplimer készlettel elvégezve a vizsgálatot a következő négy kritérium teljesül:

7 1. szignifikáns erősítési jelek mutatkoznak a vizsgált mintával végzett reakcióban, 2. nincs erősítési jel az ellenőrző mintában, 3. nincs erősítési jel a negatív ellenőrző mintában, 4. szignifikáns erősítési jel mutatkozik a vizsgált mintában, ha a kimutathatósági határnak megfelelő kimutatandó anyagot adnak hozzá. Ha a vakpróbában vagy a negatív próbában szignifikáns jelet kapnak, a mérés érvénytelen, mert a minta szennyezett. Ha a minta a kimutathatósági határ alatt van, három mérésből még kapható egy vagy két pozitív jel, de mivel az ilyen minták C T -értéke 40 fölötti, nem adnak szignifikánsan eltérő jelet a negatív mintákétól. Ilyen esetekben a megbízhatósági intervallumban vannak olyan pozitív erősítési jelek, amelyek a mintáktól származnak, de ezek átlapolnak a negatív minták jeleivel. Ezeket olyan bizonytalan jeleknek kell tekinteni, amelyeket a validált kimutathatósági határ alatt levő koncentrációban jelen levő anyag okozott. Ilyenkor meg lehet próbálkozni nagyobb mintamennyiség extrakciójával, vagy meg lehet vizsgálni a fertőzőképességet és a végpontot kimutatni Q-PCR módszerrel. Negatív eredményről akkor lehet beszélni, ha sem a vizsgált mintában, sem az ellenőrző mintában, sem a negatív ellenőrző mintában nem lép fel erősítés, a pozitív kontrollpróbában viszont igen. A mennyiségi vizsgálatok validálásakor legalább nyolc párhuzamost kell mérni egy-egy koncentrációnál, és egyazon DNS- vagy RNS-mintából több hígítást kell készíteni. Az analízis során négy párhuzamost standardként, másik négyet pedig ismeretlenként kell kezelni. A kalibrációs görbe megszerkesztése után a szoftver segítségével az ismeretlenek mennyiségét és a mérés pontosságát meg lehet határozni (3. táblázat). 3. táblázat A kópiaszám-meghatározás pontossága Q-PCR próba Tényleges (X) Számított (Y) Gazdasejt DNS (pg) 300 pg 324 pg ± pg 31 pg ± 14 3 pg 3 pg ± 2 Enterovírus (virális RNSkópia) ± ± 97 Kórokozók kimutatása és mennyiségi meghatározása A vakcinákban vagy gyógyászati anyagokban esetleg véletlenül előforduló kórokozók nagyon veszélyesek, ezért kimutatásukra indokolt érzékeny

8 módszereket használni, pl. a Q-PCR módszert. Számos vírusos kórokozóhoz kapható megfelelő próba. Ugyancsak fontos a retrovírusokkal való szennyezettség kimutatása, amit a reverz transzkriptáz aktivitásának kimutatásával lehet jelezni. A reverz transzkriptázok kimutatásának nagyon érzékeny eszköze a fluoreszcens termékkel erősített reverz transzkriptáz (RT) próba (F-PERT), amely szer érzékenyebb, mint a retrovírusok kimutatására használt hagyományos próba. Érzékenysége miatt elsősorban ezt a módszert használják élő vírusos vakcinák, génterápiás készítmények retrovírusokkal szembeni szűrésekor vagy xenotranszplantációs kezelés előtt az endogén sertés retrovírus (PERV) kimutatására. A F-PERT reverz transzkriptáz függő Q-PCR próba, amely kombinálja a fajlagosságot a nagy érzékenységgel. A próba lényege, hogy az RNS-templátot cdns-sé alakítják, majd ezt termékspecifikus primerek segítségével felerősítik. Mivel nem adnak hozzá a rendszerhez külső reverz transzkriptázt, cdns csak akkor keletkezik, ha a minta maga tartalmaz ilyen enzimet. A módszer előnye, hogy különbséget tud tenni a retrovírusok RTaktivitása és a DNS-polimerázok RT-szerű aktivitása között. Ezt azzal érik el, hogy aktivált borjú csecsemőmirigy DNS hozzáadásával elnyomják a sejtből származó és a Taq DNS-polimerázok aktivitását, miközben változatlanul hagyják az RT-aktivitást. A F-PERT segítségével számos retrovírus aktivitása jelezhető, köztük a sertés endogén retrovírusé (PERV), az egér leukémia vírusé (MLV), a majom immunhiány vírusé (SIV mac ) és a mókusmajom retrovírusé (SMRV). A kimutathatósági határ mintegy 1000 virionrészecske. A nagy érzékenység miatt ez a módszer lényeges szerepet játszik a vakcinák és egyéb biotechnológiai termékek retrovírus-mentességének ellenőrzésében, ahol ennek jelentősége van. Ha együttes tenyésztéssel, indukcióval vagy fertőzési vizsgálatokkal együtt végzik, valamint elektronmikroszkópos és kórokozóspecifikus vizsgálatokkal egészítik ki, részletes kockázatelemzést lehet végezni. Vírus-nukleinsavak kimutatása és mennyiségi meghatározása A vírusok sokféle forrásból fertőzhetik meg a sejtvonalakat. A vírusok származhatnak abból az egyedből, amelyből a sejtvonal származik, jelen lehetnek állati eredetű vírusok a közegben vagy a szövettenyészet reagenseiben vagy külső forrásból is bejuthatnak, ha nem GMP követelményeknek megfelelő körülmények között készül a sejttenyészet. Ezért ha sejttenyészetet, primer sejteket vagy szövetkészítményeket terápiás célra kívánnak felhasználni, gondosan ellenőrizni kell bennük sokféle vírus hiányát. A vizsgálandó vírusok jellege függ a sejtvonal eredetétől és a készítésekor felhasznált nyersanyagoktól. Az ilyen jellegű termékek sikerének és marketing értékének kulcsa a megfelelően kidolgozott tisztaság-ellenőrzési módszer. Ma már több

9 tucat vírus kimutatásához szükséges Q-PCR módszer áll rendelkezésre. Humán szövetből vagy vérből nyert termékek esetében természetesen elsősorban humán vírusokat keresnek. Példaként említhetők az egér humán és humán humán hibridómák, vagy a terápiás célokat szolgáló adenovírus vektorok termeléséhez használt humán sejttenyészetek. Olyan vírusokat kell elsősorban kiszűrni, amelyek súlyos rákos betegségekkel hozhatók összefüggésbe vagy amelyek bármilyen módon megfertőzhetik a sejteket, pl. késleltetett vagy abortív osztódást mutathatnak a sejtekben. Állati eredetű vírusokkal kell számolni akkor, ha a sejtvonal vagy a gyógyászati anyag állati eredetű és/vagy ha a sejttenyészetek előállításakor állati eredetű terméket (pl. borjúembrió-szérumot, tripszint, inzulint) használtak fel. Minden gyártásnál felhasznált, állati eredetű reagenst megfelelő módszerekkel meg kell vizsgálni. A borjúszérum vagy a sertéstripszin szűrésére pl. az USAban egy szövetségi előírás szerinti 9CFR próbát használnak, de ennél érzékenyebb a Q-PCR módszer. Itt csak három olyan vírussal foglalkozunk, amelyek kimutatására az utóbbi időben vált fontossá. Borjú poliómavírus (BPyV) Ezt a vírust azért keresik, mert olyan családhoz tartozik, amely saját gazdájában vagy heterológ gazdákban is rákkeltő hatású. Az állatok fertőzése elég gyakori, és a borjúembrió szérum minták mintegy 70%-ában kimutathatók BPyV szekvenciák, és néhány mintából maga a vírus is kimutatható. Ennek a vírusnak az egyik legriasztóbb vonása, hogy emberszabásúak sejtjeiben is szaporodik, és bár az általános populációban hiányzik a megfelelő antitest, az állatorvosok 70%-a a szarvasmarha-tenyésztők mintegy 50%-a szeropozitív. A Q-PCR módszerrel 100 vírusgenom kópia rutinszerűen kimutatható. Bunyavírus A Bunyaviridae családhoz 300 vírus tartozik, amelyek 5 nemzetségbe oszthatók. Más burokkal rendelkező vírusoktól eltérően a Golgi apparátushoz tartozó citoplazmán belüli hólyagocskákban szaporodik, és nm átmérőjű virionokat hoz létre. A vírusgenom három szálra szegmentálódik, ami az influenzavírusokhoz hasonlóan komplex átrendeződéseket tesz lehetővé. Ez megnehezíti az ebbe a csoportba tartozó vírusok kimutatását. A Bunyamwera szérumcsoporton belül a Cache-völgy-vírust (CVV) tartják számon, mint amely szarvasmarhákat vagy juhokat megfertőzhet. A fertőzés veleszületetten átörökölhető, ezért elképzelhető az embriószérum fertőződése, és ez nagy problémát jelenthet a nagyléptékű sejttenyészetekben. Mivel a vírus jelenléte magzati rendellenességeket okozhat borjakban, kimutatására nagy gondot fordítanak. A CVV kimutatására ICH alapelvek szerint validált kvantitatív RT-PCR módszer áll rendelkezésre, amely már 100 vírus-rns kópia kimutatására alkalmas. Az ilyen mennyiségű RNS-t tartalmazó minták C T -értékének 95%-os

10 megbízhatósági intervalluma szignifikánsan különbözik 100 ng nem fertőzött sejt-rns minta hasonló értékeitől. Szarvasmarha és sertés cirkovírus A cirkovírusok a legkisebb méretű emlősvírusok közé tartoznak (mintegy 17 nm átmérőjűek) és a parvovírusokhoz hasonlóan igen ellenállóak. A 2. típusú sertés cirkovírus (PCV2) bizonyos homológ szekvenciákat mutat a szarvasmarha cirkovírushoz (BCV) és kimutatták, hogy bizonyos szervkárosodásokhoz vezet sertésekben. A hasonlóság alapján gyanítják, hogy ez a vírus képes átlépni a fajhatárokat. A cirkovírusok bizonyos esetben rejtettek (latensek) maradhatnak és in vitro körülmények között nem fertőző állapotban megmaradhatnak. A kimutatásukra alkalmazható módszerek köre korlátozott, és jelenleg nem áll rendelkezésre módszer, amely különbséget tudna tenni a fertőző vírus és a nukleinsavak között. A hasonló génrészletek alapján olyan Q-PCR primereket fejlesztettek ki, amelyekkel a törzsek jó része kimutatható. Az ICH előírások szerint validált Q-PCR módszer mintegy 100 genomkópia kimutatását teszi lehetővé. Mivel a fenti vírusok hatása nem jelentkezik azonnal a sejteken, a sejttenyészetekben indokolt jelenlétük rendszeres ellenőrzése. Vírusmentességi vizsgálatok Az eljárások validálásakor általában a gyártási tisztítási folyamat kicsinyített mását használják. Ez lehetővé teszi annak eldöntését, hogy a folyamat milyen mértékben képes eltávolítani és/vagy dezaktiválni a vírusokat, DNSvagy egyéb szennyezőket. Minden olyan cégnek, amely rágcsáló sejtvonalakból készít rekombináns fehérjéket, pl. hibridómákat vagy CHO-t (hörcsögpetesejt), a klinikai I/II. fázisban igazolnia kell a termék mentességét az egér leukémia vírustól. A klinikai III. fázisban még további 3 4 vírus hiányát kell igazolni. Elsősorban fertőzési vizsgálatokat írnak elő, de ahol ez nem végezhető el, egyéb eljárások is megengedettek. A gyártók egyre nagyobb része alkalmazza a Q-PCR vizsgálatokat ilyen célra. Xenotróp MLV vírusmentesség kimutatása Az egér leukémia vírusok olyan endogén provírusok, amelyek két csoportba sorolhatók: az ekotróp és a nem-ekotróp vírusok közé. Az ekotróp vírusok csak egérsejteket fertőznek, a nem-ekotróp vírusok pedig három csoportba sorolhatók: a xenotróp, a politróp és a módosított politróp vírusok közé. A xenotróp MLV megfertőzhet emberi sejteket, a politróp MLV-k megfertőzhetnek mind rágcsáló, mind nem-rágcsáló sejteket és szélesebb körben találhatnak gazdasejteket, mint a xenotróp típusok. A xenotróp és az ekotróp MLV-től

11 eltérően a fertőző politróp MLV nem létezik eleve az egér csíravonalban, hanem rekombináció útján keletkezik fertőző ekotróp MLV és endogén, MLV-hez hasonló politróp szekvenciákból. Bizonyos laboratóriumi egértörzsekben számos nem-ekotróp MLV leszármazottja rekombinálódhat exogén vagy endogén MLV szekvenciákkal, amelyek onkogén variációkat (pl. MCF vírus) eredményezhetnek. Fertőzőképes vírusok létrehozására alkalmas xenotróp MLV provírusok előfordulhatnak beltenyésztett egérpopulációkban. Gyógyászati monoklonális antitestek előállítására alkalmas egér hibridómasejtek képesek a xenotróp MLV expressziójára és a hatóságok előírják a retrovírusok inaktiválását vagy eltávolítását a gyártási folyamat során. Az MLV-t emellett modellként is lehet használni a nem fertőző CHO-sejt retrovírus-részecskék eltávolításának ellenőrzésére. A retrovírus-részecskék eltávolítására alkalmas módszer pl. a kis ph-jú elúció a gyártás során. A kisebb léptékű retrovírus-eltávolítási kísérletekben ismert mennyiségű fertőzőképes vírust adnak hozzá, és ezzel ellenőrizni lehet az eltávolítás hatásfokát vagy a Q-PCR módszer analitkai hatékonyságát. Ha a kromatogáfiás elválasztásnál olyan puffert használnak, amely inaktiválja a vírust, a fertőzőképes vírus titerének változását mind a kromatográfiás módszer, mind a pufferes inaktiválás okozza. Ezekben az esetekben a fertőzési vizsgálatok nem szolgáltatnak megfelelő eredményt az eltávolítás hatékonyságának ellenőrzéséhez, a Q- PCR viszont igen. A kvalifikációs eljárásban először kvantitatív méréseket kell végezni olyan mintákon is, amelyhez nem adtak hozzá ismert mennyiségű fertőző vírust, meg olyanokon is, amelyekhez hozzáadtak. Az X-MLV nukleinsav-kópiák analízisekor RT enzim hiányában meg lehet becsülni a provírusos cél-dns-ek százalékos mennyiségét, amelyek a sejtvonal háttérként jelenlevő maradék gazdasejt DNS-éből származhatnak. Ha visszaszámolják az RNSkópiaszámot, biztos, hogy csak a vírus-rns mennyiségét veszik figyelembe, és az eredményekben a maradék, termelő sejt genomból származó integrált provírusok már figyelembe vannak véve. Olyan minták oszlopelúciójánál, amelyek már tartalmaznak xenotróp MLV-t, az RNS extrakciójakor olyan vírust is ráinjektálhatnak belső extrakciós/amplifikációs kontrollként, amely eltér az MLV vírustól. Ilyenkor el kell kerülni, hogy a belső standard keresztreakciót mutasson az aktuális xenotróp MLV vírussal, hogy minél egyszerűbb legyen a számolás. Az extrakció során a vírusvisszanyerés és a PCR/extrakciós interferencia ellenőrzésére egy másik, ismert TCID 50 értékű vírust vagy csupasz vírus-rns-t használnak. Az X-MLV-eltávolítási vizsgálatok mellett aranyhörcsög petesejtekben (CHO) levő endogén retrovírusok és SV40 vírusok eltávolításának ellenőrzésére alkalmas Q-PCR próbák is kaphatók. Mindezt figyelembe véve jó esély van arra, hogy a Q-PCR módszerrel könnyen és kvantitatív módon lehessen gyógyászati vagy biotechnológiai termékek vírusmentességét ellenőrizni és dokumentálni.

12 Gazdasejt-DNS-sel való szennyezettség vizsgálata A biogyógyászati termékek gyártóinak be kell bizonyítaniuk, hogy a kiindulási sejtszubsztrátumokból gyártott termékek csak minimális mennyiségben tartalmaznak gazdasejt DNS-t. Az FDA és a WHO ajánlásai szerint a folyamatos sejtvonalakból gyártott termékek legfeljebb 100 pg sejt-dns-t tartalmazhatnak dózisonként. A maradék DNS különböző veszélyeket okozhat: pl. aktivált sejtes és/vagy vírusos onkogének hatására malignus (rosszindulatú) transzformáció alakulhat ki, hibás génexpresszió vagy génszekvencia-beékelődés léphet fel érzékeny szabályozó génszakaszokon vagy vírus DNS-ből fertőző vírus alakulhat ki. Ennek elkerülésére számos Q-PCR próbát dolgoztak ki maradék gazdasejt-dns kimutatására (4. táblázat). A maradék DNS Q-PCR próbák kvantitatív meghatározási limitje általában 5 pg/reakció vagy pg (10 20 genomekivalens)/ml. Ilyen érzékenység várható, ha olyan célmolekulát használnak, mint a béta-aktin gén. Az érzékenység tovább növelhető, ha olyan célmolekulát választanak, amelyből több kópia is van, pl. amelyből szekvenciaismétlődés lép fel a genomon belül. Jelenleg folyik olyan Q-PCR próbák fejlesztése, amelyek ezekre az ismétlődő régiókra irányulnak rágcsálókban vagy főemlősökben, és amelyekkel az érzékenység a fg tartományba vihető. A β- aktin gének felhasználásának viszont megvan az az előnye, hogy ezek stabil gének, és stabil sejtvonalban ezek a célmolekulák nem változtatják a kópiaszámukat. Az ismétlődő szekvenciákról ismert, hogy kevésbé stabilak, ezért nehéz megbízható mennyiségi adatokat kapni segítségükkel. 4. táblázat ICH irányelvek szerint validált Q-PCR próbák szennyező maradék gazdasejt-dns kimutatására. Gazdasejt Célgén (Q-PCR) Érzékenység (Q- PCR) Érzékenység (hibridizáció) 293 Adenovírus E1 500 fg 5 pg 50 pg E. coli 23S RNS 500 fg a 100 pg HeLa HPV-18 E pg 50 pg Emberszabású β-aktin 5 50 pg 50 pg Rágcsáló (CHO) GAPDH 500 fg 5 pg 20 pg Rágcsáló (egér) GAPDH 500 fg 5 pg 20 pg Pichia β-aktin 500 fg 5 pg nincs meghatározva Csirke β-aktin 5 pg nincs meghatározva Sertés PERV 500 fg 5 pg nincs meghatározva Rövidítések: PERV: sertés endogén retrovírus, GAPDH: glutáraldehid-6-foszfát-dehidrogenáz. a A próba háttér jelnagysága E. coli DNS-re számolva kevesebb, mint 50 fg-nak felel meg, ezt a jelet az AmpliTAq DNS-polimerázban jelen levő maradék DNS okozza. b Slot-blot technika 32 P-jelzett próba használatával (genom DNS), hibridizáció és autoradiográfia.

13 A végtermék minősítése mellett a maradék-dns-analízist a gyártási eljárás validálásánál is felhasználják annak kimutatására, hogy milyen mértékben sikerült a terméket megtisztítani a gazdasejt-dns-től. Mivel némelyik vizsgálati minta valószínűleg detektálható mennyiségben tartalmaz maradék DNS-t, belső ellenőrzésként egy más gazdasejt DNS-ét is rá szokták injektálni a mintára. Ennek kimutatására természetesen az erre a DNS-re érzékeny próbát kell alkalmazni. Szekvencia-specificitás szempontjából természetesen a mérendő mintának és a belső standardnak nem szabad keresztreakciót mutatnia. Ez leegyszerűsíti a számítást. A Q-PCR sokkal robusztusabbnak bizonyult a hagyományos hibridizációs módszereknél, azoknál pontosabb, és nagyobb dinamikus tartománnyal jellemezhető. A hagyományos hibridizációs autoradiográfiás módszereknél problémát jelenthet a kalibrációs görbék elkészítése is lineáris regresszióval, ami a röntgenfilmek feketedési határával és nemlineáris érzékenységével van kapcsolatban. A Q-PCR esetében viszont lineáris válasz lép fel, miközben az érzékenysége legalább olyan jó, mint a hibridizációs eljárásoké. A Q-PCR vizsgálat ezen felül gyorsabb és jól automatizálható robotok segítségével, ami csökkenti a hibák elkövetésének lehetőségét a minták előkészítése folyamán. A Q-PCR benzonázkezelés után is képes megbecsülni a maradék DNS mennyiségét, még akkor is, ha pl. a kezelt DNS bázispárt tartalmaz. Gén- és sejtterápiás biomegoszlási vizsgálatok A Q-PCR igen lényeges a gén- és sejtterápiák hatékonyságának megállapításánál. A biodisztribúciós (megoszlási) vizsgálatok igen lényegesek az ilyen terápiás módszerek biológiai biztonságának megállapításánál, különös tekintettel az egyre szigorodó biztonsági előírásokra. Ezek az előírások a fertőzés vagy a célszövettől távolabbi, egészséges szövetekre történő géntranszfer lehetőségét vizsgálják. Ezenkívül meg kell vizsgálni a csíravonalba történő integrálódás vagy expresszió lehetőségét. Ha lehetséges, egész szerveket kell homogenizálni, megfelelő aliquot részeket kell extrahálni, a maradék homogenizátumot pedig félre kell tenni későbbi vizsgálatokra. A homogenizálás biztosítja, hogy a szervben fellépő helyi fertőzéseket is észlelni lehet. Ha a terápiás szer vírus- vagy sejtjellegű, a nekik megfelelő RNS expressziója a vizsgált szervekben azt jelezheti, hogy a vírus vagy a sejt szaporodik az adott szövetben. Ezért az ilyen vizsgálatokban a lehető legprecízebb módszereket célszerű alkalmazni, hogy kielégítsék a vizsgáló hatóság igényeit. Célszerű előzetes vizsgálatot végezni azon körülmények megállapítására, amelyeket egy általános biodisztribúciós vizsgálatban alkalmazni érdemes. Előzetes mérések biomegoszlási vizsgálatoknál A biodisztribúciós vizsgálatok nehézségei a tervezés bonyolultságából adódnak. Az előzetes vizsgálatok rendkívül különbözőek lehetnek az alkalma

14 zott terápiás vektor bonyolultságától függően. Egyszerűen fogalmazva az előzetes vizsgálatoknak arra kell választ adni, hogy megfelelően gondoskodtak-e az optimális PCR- és extrakciós körülményekről, és elég érzékeny-e a vizsgálati módszer. Jóminőségű adatokhoz arra is szükség lehet, hogy egy inaktivált vektort is előállítsanak a negatív kontrollállatoknak való beadáshoz. Ennek segítségével ellenőrizhető, hogy nem marad-e az állatokban vektornukleinsav, amely betelepszik az állati szervekbe, és különbséget lehet tenni a replikálódó vektorból származó és a visszamaradó nukleinsavak között. Ha a vektor DNS-vírus, használható Q-RT-PCR módszer is oly módon, hogy DN-áz enzimet juttatnak be az extrakció során, és egy negatív RT reakciókontroll segítségével különbség tehető a vírusexpresszió és az állati szövetben visszamaradó DNS között. Az inaktiválási módszer maga függ a vírustól, és történhet UI-sugárzással, vagy β-propiolaktonos kezeléssel. Az inaktivált preparátumot amplifikációs (erősítési) vizsgálatokkal sejttenyészetben verifikálni kell és a szaporodó vírus meglétét vagy hiányát megfelelő jelzési módszerrel ki kell mutatni, például citopatikus hatás alapján vagy Q-PCR módszerrel. Inaktivált vektorral kezelt egészséges sejtek bevihetők a sejttenyészetbe és több szaporítási cikluson keresztül ellenőrizhető a maradék célmolekulák felhígulása a rendszerben. A szaporítási ciklusok során a koncentráció folyamatosan ellenőrizhető Q-PCR segítségével, RT enzim jelenlétében vagy anélkül, hogy bizonyítsák a maradék vírus-nukleinsav mennyiségének csökkenését és az alacsony szintű fertőzés hiányát. A próbamódszer fejlesztése és validálása során ellenőrizni kell a kimutathatósági határt, a linearitást és a reprodukálhatóságot. Ha a reakciókörülmények optimálisak, negatív kontrollszervekhez aktív hatóanyagot adva vizsgálják a mintákat, hogy meghatározzák a legkisebb még kimutatható mennyiséget az állati szövetekben. Az optimális extrakciós körülmények azután alkalmazhatók a biodisztribúciós vizsgálatokban. A vizsgálat megtervezése Döntő jelentőségű, hogy a biodisztribúciós vizsgálatokban milyen állatfajt használnak. Az adott fajt az ellenőrző hatóságnak el kell fogadnia ilyen jellegű vizsgálatokban, és jelentős mennyiségű háttér irodalommal kell rendelkezni az adott fajról. Az adott állatfajnak fertőzhetőnek kell lennie. A bevitel módja azonos is lehet a humán körülmények között alkalmazottal, de az intravénás bejuttatás jobb körülményeket biztosít a biodisztribúció ellenőrzéséhez. A vizsgálatokban az adott faj mindkét neme használhatjó, és a dózist az emberi dózis alapján állítják be az állat testtömegének figyelembevételével. A vizsgálatokban alkalmazható háromféle dózis is: A: nagy dózis ( x humán dózis), B: kis dózis (1 x humán dózis), C: nagy dózis, inaktivált állapotban. A csoportokban három hím és három nőstény állatot célszerű használni. 8, 48 és 168 óra után egy állatot megölnek és a vért, nyirokcsomókat, lépet, agyat,

15 veséket, ivarmirigyeket, a szívet és a májat megfelelően ellenőrzött laboratóriumi módszerek mellett kioperálják, hogy megakadályozzák a szervek közti keresztszennyeződést. A szöveteket hirtelen lefagyasztják vagy 80 o C-on tárolják a Q-PCR vizsgálat előtt. A Q-PCR ismétlések száma A megbízhatósági intervallumok megállapítása végett legalább három párhuzamost kell megmérni, de inkább többet. Ennek birtokában biztosabban lehet nyilatkozni arról, hogy egy adott minta pozitív-e vagy negatív. Ha csak 1 vagy 2 párhuzamost használnak a t-próba nagy értéke miatt nem lehet csoportokat egymással összevetni. Ha azonban korlátozott a költségvetés, lehet 2 párhuzamossal dolgozni, ilyenkor az átlag és szórás felhasználásával 68,2%- os megbízhatósági intervallum számítható. Egyetlen mérés esetében viszont még a reprodukálhatóságot sem lehet megbecsülni, ezért az ilyen adatot legfeljebb kutatásban lehet felhasználni, de nem biztonsági vizsgálatokban, ahol a konfidencia-intervallum ismerete elengedhetetlen. A teljes dinamikus tartományt átfogó kalibrációs görbe készítéséhez legalább 4 5 standard mintát kell használni, amelyeket 10-szeres hígítási sorral állítanak elő. Ez már elegendő ahhoz, hogy a PCR vizsgálat egész tartományában biztonsággal megállapítsák a C T -értékeket. Ellenőrző vakpróbák Mivel a génterápiás vektorokkal kezelt állatok valószínűleg tartalmaznak PCR-pozitív szöveteket, szükség van vakpróbákra is, különben nem lenne semmilyen ellenőrző adat a minták közti keresztszennyeződésre az extrakció során. A vakextraktum fontosságát az mutatja, hogy a reakció vakpróbája lehet negatív, de az extraktum vakpróbáé pozitív. Belső standard a minta DNS-ére Ez az ellenőrzés azt bizonyítja, hogy a vizsgálati állat DNS-ét ki lehet nyerni. Azért van erre szükség, mert az extrakciós eljárás validálását más időpontban végezték, mint magáét a mérőmódszerét. Ez az ellenőrzési lépés elhagyható, ha megvizsgálják az extrakció előtt ráinjektált DNS kinyerését feltéve, hogy a cél-dns nem integrálódik a sejt-dns-be. Ráinjektált minta visszanyerésének ellenőrzése Ha nem ellenőrzik a vektor-dns integrálódását a gazdasejt genomjába, mind extrakció előtti, mind extrakció utáni ráinjektálásos vizsgálatokat kell végezni annak eldöntésére, hogy milyen hatásfokú az extrakció, és hogy fellép-e valamilyen inhibíció a PCR folyamán. Jóllehet már az előzetes vizsgálatban a nukleinsav-extrakció validálása választ ad erre a kérdésre, a vizsgálati minta biodisztribúciós vizsgálata ettől eltérő időpontban készül. Eközött a két időpont között változhatnak pl. a felhasznált oldatadagok, a mérést végző személyek,

16 extrakciós reagensekhez kapcsolódó problémák vagy hibák. Ha elvégzik a ráinjektált minták visszanyerésének ellenőrzését, ezekre a problémákra is fény derülhet. Belső pozitív kontrollok (IPC) A Q-PCR oldatokba bevihetnek IPC-ket, más néven TaqMan exogén belső pozitív standardokat. Ezek helyettesíthetik az extrakció utáni ráinjektálást, mivel a PCR gátlását az IPC reagensekkel ellenőrzik. Az IPC alkotórészei között vannak bizonyos primerek és próbák, amelyek nem biológiai, hanem szintetikus templátra irányulnak. A multiplex PCR reakcióban az IPC-t egy VIC-jelölt próbával a vírus/sejt célnukleotidot pedig egy FAM-jelölt próbával detektálják. Az IPC reagenseket azért adják a reakcióközeghez, hogy különbséget lehessen tenni a célmolekulára nézve valóban negatív minták és a PCR-inhibíció között. Ezenfelül a PCR-negatív mintákból nyert adatok IPC jelenlétében biztosítják, hogy azok valóban negatívok a vírus célmolekulára nézve, tovább erősítve a mérési eredmények megbízhatóságát. Génkópiaszámok és genetikai stabilitás Vírusok kimutatása és kvantitatív mérések mellett a Q-PCR-t széles körben használják arra, hogy kimutassák pl. a génkópiák számában beálló változásokat, m-rns-ek expresszióját vagy megmérjék a plazmid DNS-ek koncentrációját. A DNS-szekvenálással és restrikciós feltérképezéssel kombinált Q-PCR jól használható a genetikai stabilitás vizsgálatához. A Q-PCR kutatás fejlesztési alkalmazásai között említhetők az alábbiak: 1. plazmid DNS kópiaszámának megváltozása E. coli-ban vagy élesztő sejtbankokban mind kutatás, mind nagy léptékű ipari alkalmazás során, 2. kromoszoma-integrált expressziós kazetták transzgénkópia-számának megváltozása (élesztő és emlős sejtbankok), 3. transzgénikus m-rns-ek kópiaszámának megváltozása az expresszió szintjének megbecslésére és 4. a génexpresszió megváltozásának követése bizonyos terápiás szerek hatására. Plazmid-DNS kópiaszám A modern oltási eljárásokban gyakran használják azt a módszert, hogy közvetlenül visznek be rekombináns plazmid-dns génterápiás vektort a megfelelő szövetbe. Ennek részeként kationos lipidekkel komplexált plazmid- DNS-t visznek be genetikai eredetű vagy szerzett betegségek gyógyítására. Mióta a plazmidokra nagyobb figyelmet fordítanak génterápiás vektorkészítményekben való felhasználásuk miatt, a stabilitásuk és hozamuk ellenőrzésé

17 re szolgáló módszerek alapvető jelentőségűekké váltak. A stabil sejtvonalak elkülönítése és a kiválasztott sejtvonalak termelésre alkalmassá tétele szempontjából fontos, hogy ellenőrizni tudjuk a transzgenikus kópiaszámok változásait és az m-rns-expresszió mértékét. A terápiás plazmid-vektorok ipari léptékű gyártását és tisztítását azonban számos körülmény nehezíti (bakteriális gazdatörzs, plazmid-dns instabilitása, sejtenkénti kópiaszám). A restrikciós endonukleáz-térképezéssel, nukelotidszekvencia-analízissel, fenotípusellenőrzéssel együtt a plazmid kópiaszám rutinszerű elemzése igen fontos a nagyméretű tenyészetek ellenőrzése szempontjából, ahol a genetikai instabilitás komoly problémákat okozhat. A plazmid-dns kópiaszámának meghatározására szolgáló módszerek meglehetősen munkaigényesek, szükség van DNS-extrakcióra, restrikciós endonukleáz emésztésre, agaróz elektroforézisre és etidium-bromid festésre. Ezért nagy igény van olyan nagy teljesítményű módszerekre, amelyek a plazmidvektor konstrukciók kópiaszámának meghatározását lehetővé teszik a fermentáció során, mert csak így lehet optimálni a feldolgozási lépéseket. A Q-PCR analízis célterületei között szerepelnek a plazmid replikációs origója, az antibiotikus rezisztenciagén, a humán CMV promoter vagy a terápiás transzgén ezek segítségével azonosíthatók a plazmidkópiaszámban bekövetkező változások. A sejtszám és a C T közti korreláció vizsgálatával lineáris összefüggést állapítottak meg, aminek segítségével a plazmid-dns kópiaszáma közvetlenül megállapítható egy adott sejttenyészetben a referencia plazmidot tartalmazó E. coli törzshöz képest. A kvantitatív Q-PCR módszer lehet relatív vagy abszolút. A relatív menynyiségi meghatározás során belső standardot használnak a mintában levő plazmidmolekulák normalizálása céljából. A normalizált érték információt ad a kópiaszámok szignifikáns növekedéséről vagy csökkenéséről, és független a hagyományos sejtszámlálás hibájától. A relatív mennyiségi mérés lehetőséget kínál arra, hogy különböző kolóniákat vagy sejttenyészetek különböző térfogatait közvetlenül összehasonlítsanak egymással. A relatív mennyiségi mérés segítségével numerikus különbség számolható az endogén kromoszomális gén és a plazmidmolekulák között. Így a plazmid célmolekula és az endogén belső standard közötti szignifikáns eltérések észlelhetők, ami információt szolgáltat a sejtenkénti plazmid-dns-molekulák számáról. E megközelítéssel a próbát függetleníteni lehet az OD 600 szabványtól, de a kópiaszám 2 4-szeres változásait detektálni lehet. A kromoszomálisan integrált transzgének stabilitása A Q-PCR használható a kópiaszám változásának mérésére széles sejtszám-tartományban, különböző genomekvivalensek mellett, és lehetővé teszi a kópiaszám meghatározását különféle típusú (master, munka és termelési)

18 sejtbankokban. A szignifikáns változásokat a C T -értékek megbízhatósági intervallumának statisztikai analízisével lehet meghatározni. A Q-PCR pontosabban tudja megállapítani a kópiaszám változását, mint a southern blot módszer, amely autoradiogáfiás intenzitásmérésekre épül. A southern blot vizsgálat hasznos információkat ad az integrált konstrukció szerkezeti épségéről, de csak közelítő adatokat szolgáltat a kópiaszámról. Ami a stabilitást illeti, a kópiaszám növekedésére akkor kerül sor, ha a transzgénikus sejtben kromoszómakettőződés lép fel. Ha a kópiaszám szignifikáns növekedése észlelhető, fluoreszcens in situ hibridizációs analízist kell végezni a stabilitás ellenőrzésére. A southern analízis nem mutatja ki a kromoszómakettőződést, ha nem jár egyéb szerkezeti változással is, ha az integrált expressziós kazetta nem változik meg a duplikáció során. A szerkezeti analízis csak az expressziós kazettában mutatja ki a változást (deléció, beékelődés, rekombináció/duplikáció egy más kromoszómahelyen). Ezért a Q-PCR módszerrel végzett gyors analízis segít a duplikáció kimutatásában, amely kópiaszámnövekedést okoz, de nem jár egyéb szerkezeti változással, és így a southern blot analízis nem mutatja ki. Következtetések Az ismert vírusok számának gyors növekedése miatt a biztonsági kérdések egyre fontosabbá válnak a biotechnológiai eljárásokban. Egyre nő az igény a gyors vizsgálati módszerek kidolgozása iránt, amelyeket az eljárások optimálásánál és validálásánál lehet alkalmazni. Most, hogy már valdiált Q- PCR módszerek állnak rendelkezésre, a biotechnológiai termékek tisztaságának meghatározása jóval könnyebbé vált. A Q-PCR módszer sokoldalúsága, reprodukálhatósága és nagy teljesítőképessége hozzájárul a fejlesztési idő csökkentéséhez és az új biotechnológiai termékek gyorsabb piacra jutásához. (Bánhegyiné Dr. Tóth Ágnes) Lovatt, A.: Applications of quantitative PCR in the biosafety and genetic stability assessment of biotechnology products. = Reviews in Molecular Biotechnology, 82. k. 3. sz jan. p Biel, S. S.; Held, K. H. stb.: Rapid quantification and differentiation of human polyomavirus DNA in undiluted urine from patients after bone marrow transplantation. = Journal of Clinical Microbiology, 38. k p Brorson, K.; Schwann, P. G. stb.: Use of quantitative product enhanced reverse transcriptase assay to monitor retrovirus levels in mab cell-culture and downstream processing. = Biotechnology Progress, 17. k. 2. sz p