ÁLLATI ADENOVÍRUSOK KIMUTATÁSA ÉS RENDSZEREZÉSE

Átírás

1 MTA DOKTORI TÉZISEK ÁLLATI ADENOVÍRUSOK KIMUTATÁSA ÉS RENDSZEREZÉSE Benkı Mária Budapest 2009

2 BEVEZETÉS Téziseimben az állati adenovírusok által képviselt biodiverzitás felmérésére irányuló vizsgálataink eredményeit, illetve az ezek alapján kidolgozott diagnosztikai módszerek bemutatását tartalmazó közleményeimet foglalom össze. A közel két évtizeddel ezelıtt megvédett kandidátusi értekezésem (Benkı, 1990) a hasítottkörmő háziállatok adenovírusainak, DNS-vizsgálatokat is magában foglaló, jellemzésével kapcsolatos kutatómunkámon alapult. Az akkori vizsgálatok eredeti célja az elsıként hazánkban felismert és jellemzett, különleges szarvasmarhaadenovírusok (Bartha, 1969) pontos rendszertani helyének tisztázása volt. Laboratóriumunkban azóta is intenzíven folytatódtak az állati adenovírusok kimutatásával, azonosításával és rendszertani besorolásával kapcsolatos kérdések megválaszolására irányuló kutatások. Ezt jól illusztrálja az adenovírus témában 1996 óta laboratóriumunkban született hat PhD értekezés, valamint a magyar és külföldi állatorvos-, biológus- és zoológushallgatók által készített számos szakdolgozat. Eredményeink jelentıségét és külföldi elismertségét jelzi, hogy a Nemzetközi Vírusrendszertani Bizottság (International Committee on Taxonomy of Viruses, ICTV) 1999-ben felkért az Adenoviridae Munkacsoport (Study Group) vezetésére, és ezt a feladatot a szabályok által megengedett maximális, kétszer hároméves idıtartamig végeztem. Ezután pedig, 2006-ban, közvetlen munkatársamat, Harrach Balázst bízták meg e tevékenység folytatásával. Harrach Balázs 2002-ben védte meg MTA doktori értekezését az adenovírusok filogenetikáját, a vírus és gazdafaj közös evolúciójára vonatkozó elméletét bemutató munkájával (Harrach, 2001). A kutatási téma közelsége és részleges átfedése miatt téziseim alapjául kizárólag olyan közleményeket választottam, amelyek a fent említett doktori értekezésnek nem képezték részét, sıt túlnyomó többségük már Harrach Balázs védése után készült. Az állati adenovírusok körében olyan váratlan sokféleséget tártunk fel, amely a humán adenovírusokkal foglalkozó szakembereket ámulatba ejtette. A rendkívüli diverzitás ellenére sikerült olyan diagnosztikai módszert kidolgoznunk, amely lehetıséget teremtett további állatfajok újabb, eddig ismeretlen adenovírusainak felismerésére. Egzotikus gazdafajokban esetenként még az általunk megújított rendszertan koncepciójába és taxonjaiba is nehezen illı adenovírusokat találunk, és ennek köszönhetıen az adenovírusok taxonómiájának finomítása és pontosítása feltehetıen még hosszabb ideig aktuális marad. 1

3 IRODALMI ÁTTEKINTÉS Az adenovírusok családja (Adenoviridae) az egyik legalaposabban tanulmányozott víruscsoport. Genomjuk duplaszálú, lineáris DNS-molekula. Burok nélküli, közepes mérető (70 90 nm átmérıjő), ikozaéder alakú virionjaikat az azok csúcsain elhelyezkedı, antennaszerő fehérjenyúlvány (fiber) egyedülállóan jellegzetessé teszi. A különbözı testnedvekkel illetve váladékokkal esetenként nagy számban ürülı virionok a környezeti hatásokkal szemben meglehetısen ellenállóak, és a külvilágon huzamos ideig megırzik fertızıképességüket. Szépségük mellett rendkívül hatékony szaporodóképességük is hozzájárult ahhoz, hogy az adenovírusok napjainkban is intenzív kutatások tárgyát képezik. Az elsı adenovírusok izolálásához az Egyesült Államokban sorkatonai szolgálatra bevonult újoncok között rendszeresen megfigyelt, heveny légzıszervi tünetekkel kísért járványok célzott oktani vizsgálata vezetett (Rowe et al., 1953). Hamarosan kiderült azonban, hogy az adenovírusok a légutakon kívül számos más szervben is okozhatnak kóros elváltozást, egyebek között keratoconjunctivitist, tonsillitist, enteritist, cystitist (Benkı, 2008). A sejttenyészetekben általában jól szaporodó, a sejtek lekerekedésével járó, jellegzetes sejtkárosító hatást kiváltó adenovírus izolátumokat szerológiai vizsgálatok, nevezetesen a vírus-neutralizációs próbák eredménye alapján szerotípusokba sorolták. Az emberi adenovírus típusok száma kezdetben gyorsan növekedett, és hamarosan kiderült, hogy hasonló vírusok különbözı háziállatokban, így kutyában, szarvasmarhában, juhban, sertésben és baromfiban is gyakran elıfordulnak. A 70-es évek közepén a korabeli rendszertani elvek szerint a víruscsalád kialakításakor két nemzetséget különítettek el (Norrby et al., 1976). Az emlısök vírusait a Mastadenovirus, míg a madarakból izoláltakat az Aviadenovirus genusba sorolták. A gazdaeredet mellett a komplementkötési próbák során megfigyelt keresztreakció megléte illetve hiánya is alátámasztotta ezt a rendszerezést. Az ismert új izolátumok és szerotípusok számának emelkedésével azonban hamarosan kompromisszumokat kellett kötni, amennyiben elıbb kérıdzıkbıl, majd pedig több baromfifajból olyan adenovírusokat izoláltak, amelyek nem rendelkeztek a mast- illetve aviadenovírusokra jellemzı, közös antigénnel. Zavarba ejtı tulajdonságaik miatt e rendhagyó vírusokat a megfelelı nemzetségen belüli csoportokba elkülönítve tartották számon hosszú ideig (Wigand et al., 1982). Az elmúlt két évtizedben tanúi lehettünk a molekuláris biológiai technikák 2

4 ugrásszerő fejlıdésének és térhódításának, aminek eredményeként a PCR és a DNS-szekvenálás a laboratóriumi rutinvizsgálatok része lett, és többek között a virológiai diagnosztika területén is uralkodó módszerré vált. Más víruscsaládokhoz hasonlóan az adenovírusoknak is számos új képviselıjét sikerült ezzel a technikával ritka és egzotikus gazdafajokból kimutatnunk. Az egyre gyorsuló ütemben szaporodó részleges vagy teljes genomiális nukleotid-sorrendek elemzése lehetıvé teszi a kimutatási módszerek érzékenységének fokozását és hatékonyságuk folyamatos javítását. Az adenovírusokra vonatkozó ismereteink túlnyomó többsége azonban napjainkban is a humán adenovírusok (HAdV), ezen belül is elsısorban a Human adenovirus C fajba sorolt, nukleotid-sorrendben egymástól mindössze 2%-nyi eltérést mutató HAdV-2 és -5 tanulmányozásából származik. Csak a legutóbbi években vált közismertté és általánosan elfogadottá, hogy a korábban különféle biológiai tulajdonságaik (például hemagglutinációs spektrum vagy onkogenitás) tekintetében jellegzetes eltéréseket mutató HAdV fajok genom-szervezıdésében, fıként a korai (early) géneket kódoló E3 régióban is markáns eltéréseket lehet megfigyelni (Lichtenstein et al., 2004). Az eltérések mértéke még jelentısebb az állati eredető mastadenovírusok között (Evans et al., 1998), míg a további nemzetségekben az E1, E3 és E4 régiók valódi homológjai leggyakrabban elı sem fordulnak (Ursu et al., 2004; Corredor et al., 2006, 2008). A MUNKA CÉLJA A szarvasmarhákban talált adenovírusok két csoportjának tagjai között felismert, szembetőnı biológiai különbségeknek megfelelıen jelentıs eltéréseket találtunk e vírusok DNS-ének méretében és szekvenciájában is. Kiderült, hogy a humán adenovírusok vizsgálata során megismert, korábban univerzálisnak tekintett genomszervezıdés a valóságban nagy változatosságot mutat. E változatosság mértékének és mibenlétének vizsgálatát tőztük ki célul. Különbözı házi- és vadon élı állatfajokból izolált, vagy PCR segítségével kimutatott adenovírusok teljes vagy legalább részleges genetikai vizsgálatát végeztük el. Az egész víruscsaládban megırzött génrészletek illetve szekvenciák keresése is célunk volt, hogy lehetıség szerint valamennyi adenovírus kimutatására alkalmas, minél érzékenyebb 3

5 diagnosztikai módszert is kidolgozhassunk. Hazai és külföldi kollégák együttmőködésének köszönhetıen a gerincesek minden jelentısebb csoportjának, a halaktól az emberig, több-kevesebb képviselıjébıl sikerült adenovírust vizsgálnunk. A részleges illetve teljes nukleotid-sorrendek alapján végzett összehasonlító vizsgálatok során egyre több olyan bizonyítékot találtunk, amely alátámasztotta az adenovírusok és gerinces gazdáik közös fejlıdésére vonatkozó feltételezéseket. Céljaink között szerepelt továbbá az újonnan létrehozott, két (Atadenovirus és Siadenovirus elnevezéső) nemzetség gazdaeredetének vizsgálata, illetve az erre vonatkozó feltételezéseink megerısítése (Benkı, 2004). Az értekezés alapját képezı, csatolt, válogatott közleményekben publikált munkákat az alábbi fı témakörökben végeztük: in situ DNS-hibridizációs eljárás kidolgozása szarvasmarha-adenovírus típusok kórszövettani anyagban történı azonosítására; az adenovírusok DNS-függı DNS-polimeráz génjének kimutatására szolgáló PCR kidolgozása és alkalmazása hal- és kígyó-adenovírus vizsgálatára; nested PCR kidolgozása és tesztelése hüllı és madár eredető mintákon; adenovírus genomok megırzött részeinek azonosítása; az E3 és E4 transzkripciós egységek tartalmi változatossága az egyes adenovírus nemzetségek tagjaiban; a feltehetıen egy ötödik nemzetséget képviselı hal-adenovírus genomjának analízise. A vizsgálataink eredményeibıl levonható következtetések képezték alapját az adenovírusok minél logikusabb rendszerezése céljából elıterjesztett hivatalos taxonómiai javaslatainknak, és az ICTV jelentések elkészítése során is ezekre támaszkodtunk. Az eredeti közlemények és néhány külföldi kiadású kézikönyvbe, felkérésre írt fejezet mellé az ICTV 8. Jelentésébe az Adenoviridae család vezetésemmel immár második alkalommal összeállított leírását is csatolom. Az értekezésem alapját képezı közleményekre történı szövegközi hivatkozásokat félkövér betőtípussal emeltem ki. ANYAG ÉS MÓDSZER Vírustörzsek és vírusszaporítás Szarvasmarha- (bovin) adenovírusok közül a 10-es szerotípus prototípusát, az Új- Zélandon izolált Ruakura törzset (Horner et al., 1980, 1989), és négy újabb, Észak- Írországból származó izolátumot (Adair et al., 1996) alacsony passzázs-számú 4

6 borjúhere sejttenyészetben vagy BEL (bovine embryonic lung) sejtvonalon szaporítottuk el. A vizsgált kígyó-adenovírust gabonasiklóból (Elaphe guttata) izolálták VH (viperaszív eredető) sejtvonalon (Juhasz & Ahne, 1993). Az elszaporított és ultracentrifugálással koncentrált vírust Winnfried Ahne és Sandra Essbauer (Institut für Zoologie, Fischereibiologie und Fischkrankheiten, Ludwig- Maximiliens Universität, München) bocsátotta rendelkezésünkre. A máig is egyetlen hal-adenovírust az Észak-Amerikában ıshonos fehér tokból (Acipenser transmontanus) izolálták homológ sejtvonalon (fehér tok lép eredető epithelialis sejtjeiben). Ennek a (WSS-2 jelő) sejtvonalnak vírussal fertızött szövettenyészeteit küldte el laboratóriumunkba Scott LaPatra (Research Division, Clear Springs Foods Inc., Buhl, Idaho). Betegségben elhullott állatokból származó vizsgálati minták Az in situ hibridizációs tesztekhez a szarvasmarha minták Észak-Írországból és Olaszországból származtak. PCR vizsgálatokhoz az Egyesült Királyságból további szarvasmarha, mókus és vadmadár mintákat is kaptunk, amelyekbıl a feltételezett adenovírus izolálását is megkísérelték. Az izolálás az elsı esetben sikerrel járt, míg az utóbbiakban nem. PCR-rel szőrtük továbbá hét különbözı fajhoz tartozó beteg vagy elhullott gyík mintáját, melyek között kloaka tampon és paraffinba ágyazott, kórszövettani vizsgálathoz készített szervminták is voltak. DNS kivonás, restrikciós enzimes analízis és molekuláris klónozás Az ultracentrifugálással tisztított és koncentrált virionokból a DNS-t fenolos kivonással tisztítottuk, restrikciós endonukleázokkal emésztettük, és agarózgélelektroforézissel analizáltuk. Megfelelı mennyiségő és minıségő virális DNS esetében kettıs és hármas emésztések segítségével elkészítettük a genomok fizikális térképét (Matiz et al., 1996). Az alacsony titerben replikálódó hal- és kígyóadenovírus DNS-ének klónozásához a HindIII, PstI és SmaI enzimet találtuk alkalmasnak (Farkas et al., 2002; Kovács et al., 2003). Véletlenszerő klónozáshoz különbözı (pkh47, pmob, pbluescript, puc18), kereskedelmi forgalomban kapható plazmidokat és T4 DNS-ligázt (New England Biolabs) használtunk. A ligálási reakció után a plazmidokkal TOP10 vagy DH5α Escherichia coli törzset transzformáltunk. A plazmid DNS-t alkalikus miniprep módszerrel tisztítottuk, és agarózgél-elektroforézissel elemeztük. 5

7 DNS próba elıállítása és in situ hibridizáció A BAdV-10 referens törzsével azonos genom-térképpel rendelkezı izolátumból (Adair et al., 1996; Matiz et al., 1996) egy kb bázispár (bp) mérető, klónozott szakaszt, ami a PstI/D fragmentumnak felelt meg, használtunk hibridizációs próbaként. Kontrollként a BAdV-1 referencia törzsének DNS-ébıl az EcoRI/B fragmentumot tartalmazó plazmidot (Benkı & Harrach, 1990), valamint a BAdV-4 genomjának megközelítıleg felét hordozó, pbav401 jelő klónt (Benkı et al., 1990) használtuk. Vágatlan plazmidot és plazmidból kivágott, gélbıl tisztított DNS fragmentumot is teszteltünk. A próba DNS-eket digoxigeninnel (DIG) jelöltük DIG DNA Labelling and Detection Kit (Boehringer Mannheim) alkalmazásával. Az in situ hibridizáció kivitelezésének részletes leírása a csatolt közleményben olvasható (Smyth et al., 1996). Primer tervezés és PCR Azokból a feltételezetten vírustartalmú mintákból, amelyekbıl a vírusizolálás sikertelennek bizonyult, vagy megfelelı rendszer (elsısorban permisszív szövettenyészet) hiányában az izolálást meg sem kíséreltük, a vírus nukleinsavának kimutatását és azonosítását PCR segítségével hajtottuk végre. A PCR-hez kezdetben a HAdV-ok kimutatására alkalmasnak talált, a hexon génre irányuló primereket illetve PCR rendszereket használtunk (Allard et al.,1990; Benkı, 1990). Ezeket a 300 bp DNS-szakasz felsokszorozódását biztosító primereket késıbb kis módosítással az összes ismert BAdV (Kiss et al., 1996a) és egyéb állati mastadenovírus (Kiss et al., 1996b) kimutatására is alkalmassá tettük. Úgynevezett konszenzus, rendszerint erısen degenerált primereket az egyes fehérjék aminosav sorrendjének pozícionális illesztése (alignment) alapján terveztünk. A lehetıség szerinti legkevesebb kodonnal rendelkezı aminosavakból álló, rövid motívumokat kerestünk, és az oligonukleotid szintézise során a primermolekulákba az összes lehetséges tripletnek megfelelı nukleotidot beépíttettük. Kísérleteztünk továbbá inozit alkalmazásával is, amit a primer szekvenciák N pozicióiba szintetizáltattunk, mert ez a nukleotid-analóg a négy nukleotid bármelyikével képes párba állni. A feltehetıen alacsony vírustartalmú minták vizsgálatához az érzékenység fokozása céljából úgynevezett nested, vagyis kétkörös PCR rendszert dolgoztunk ki amerikai együttmőködésben (Wellehan et al., 2004). A primerek szintézisét fıleg a BioCenter (Szeged) vagy az 6

8 Invitrogen (Csertex) szolgáltató egységétıl rendeltük. A PCR-t leggyakrabban 50 µl térfogatban, PTC200 (MJ Research) vagy Tpersonal (Biometra) készülékben hajtottuk végre. A reakció körülményei, beleértve az alkalmazott hıálló DNS-polimeráz típusát is, nagy változatosságot mutattak a PCR termék várható méretétıl, a vizsgálni kívánt adenovírus típusától és az alkalmazott primerek fajtájától függıen. Ennek megfelelıen a ciklusok egyes lépéseinek hımérséklete és idıtartama általában a következık szerint változott: 1. Kezdeti denaturáció: C 5 perc; 2. Denaturá ció: C 30 mp; 3. Primer tapadás (annealing): C mp; 4. Szintézis (polimerizáció): 72 C 1 5 perc; 5. Befejezı szintézis: 72 C 5 10 perc. A PCR termékek várható mennyiségétıl függıen ciklusból állt a reakció. Az alkalmazott enzimek között leggyakrabban a REDTaq DNA Polymerase (Sigma) és a Phusion High- Fidelity DNA Polymerase (Finnzymes) szerepelt. A reakcióelegy MgCl 2 koncentrációját szinte minden primer pár esetében szükséges volt optimalizálni. Problémás reakciókhoz a FailSafe PCR System (Epicentre Technologies) készletet használtuk, ami tizenkétféle puffer-keveréket tartalmaz. A további részleteket az egyes közlemények megfelelı szakaszában lehet megtalálni. Genom-végi szekvenciák meghatározásához egykarú PCR-t terveztünk, legalább 23 nukleotid hosszú, kifelé irányuló primer használatával. A keletkezı, egyszálas termékekre T4 RNS-ligáz (New England Biolabs) alkalmazásával egy ismert szekvenciájú oligonukleotidot kapcsoltunk, és ennek komplementerével, valamint az eredeti primerrel kíséreltük meg a hiányzó genom-vég felsokszorozását hagyományos PCR-rel (Farkas et al., 2008). DNS-szekvenálás A nukleotid-sorrend meghatározását kezdetben, rövid ideig még klasszikus Sanger féle módszerrel, S 35 vagy P 32 izotóppal jelzett nukleotid-trifoszfát és Macrophore (Pharmacia-LKB) szekvenáló alkalmazásával is végeztem, de hamarosan áttértünk a fluoreszkáló festékkel jelzett nukleotidok használatára. A szekvenálási reakcióhoz alkalmaztuk többek között az ALFexpress AuroRead Sequencing Kit és Cy5 AutoCycle Sequencing Kit (Pharmacia Biotech), SequiTherm EXCELII Long-Read DNA Sequencing Kit-ALF (Epicentre Technologies), valamint BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) nevő készleteket. A reakciók elektroforézise eleinte az Országos Állategészségügyi Intézet ALFexpress 7

9 (Pharmacia Biotech) szekvenálóján történt, majd különbözı, hazai szolgáltatóktól (Biocenter, Szeged; BIOMI, Gödöllı) rendeltük meg, akik ABI373A, vagy újabban ABI3100 (Applied Biosystems) típusú automata DNS-szekvenálót használnak. Szekvenciák számítógépes analízise A szekvenáló szolgáltatótól kapott adatokat a BioEdit program (Hall, 1999) segítségével kezeltük. A szekvenciák azonosítását minden esetben elvégeztük a BLAST programok használatával az NCBI génbankjában vagy saját adenovírus adatbázisunkban történı kereséssel. Az átfedı szekvencia szakaszok összeillesztését kezdetben a PC/Gene (IntelliGenetics) és Lasergene (DNASTAR) programcsomagok Assemgel illetve SeqMan programjainak segítségével végeztük. Újabban inkább a robosztus és ingyenes Staden csomagot használjuk (Staden, 1996). A nukleotid-sorrendek lefordításához a JavaScript DNA Translator (Perry, 2002) on-line elérhetı változatát vettem igénybe. Az azonosított, homológ aminosav szekvenciákból pozícionális illesztés készítéséhez a MultAlin (Corpet, 1988) vagy a ClustalW (Thompson et al., 2002) programot használtuk. A pozícionális illesztéseket a PHYLIP csomag különbözı programjainak használatával elemeztük. A törzsfa-rekonstrukciók megbízhatóságát úgynevezett bootstrap analízissel ellenıriztük. E vizsgálatok menetének részletes leírása a cikkeinken kívül könyvfejezetben is megjelent (Harrach & Benkı, 2007). EREDMÉNYEK Bovin adenovírusok típus-specifikus kimutatása in situ DNS-hibridizációval A klónozott virális DNS-bıl készült, jelölt próbák in situ hibridizációs vizsgálat során a BAdV-1 és BAdV-4 esetén a kórokozó alcsoport- (helyesebben genus-), míg a BAdV-10 esetén típus-specifikus kimutatását tette lehetıvé kórszövettani metszetekben (Smyth et al., 1996). Hatékonyság szempontjából nem találtunk különbséget a teljes plazmidból, vagy a vektorból kivágott DNS fragmnetumból készült a próba alkalmazása esetén. Keresztreakciót a háromféle BAdV próba között nem tapasztaltunk. Ismert volt viszont, hogy az atadenovírus (korábban 2. alcsoportba tartozónak nevezett) BAdV-ok DNS-e közötti nagyfokú hasonlóság miatt (Benkı et al., 1990) a BAdV-4-bıl készült próba a BAdV-5, -6, -7 és -8 8

10 tartalmú mintával is pozitív reakciót ad. Hasonlóképpen a BAdV-1-bıl készített próba sem bizonyult alkalmasnak a mastadenovírus (korábban 1. alcsoportbeli) BAdV-ok, nevezetesen a BAdV-1, -2, -3 és -9 megkülönböztetésére. A jellegzetes, fibrines-vérzéses enteritisben elhullott, 13 fiatal szarvasmarha mintáinak mindegyikét csak a BAdV-10 jelenlétére találtuk pozitívnak, ami tovább erısítette a vírus fokozott patogenitására vonatkozó feltételezésünket (Smyth et al., 1996). Az elsı szekvenciák hal- és hüllı-adenovírusból A DNS-függı DNS-polimeráz gén egy-egy szakaszát PCR segítségével mutattuk ki a gabonasikló és a fehér tok adenovírusából, majd a PCR termékek nukleotidsorrendjét meghatároztuk (Benkı et al., 2002). Ezek a világon az elsı DNSszekvenciát jelentették hüllık és halak adenovírusából. A filogenetikai fa az elıbbit az atadenovírusok közeli rokonának mutatta, míg a tokhal-adenovírus önálló ágon helyezkedett el. Adenovírusok kimutatása gyíkokból és ragadozómadarakból A nested PCR alkalmazásával hat új gyík-adenovírus szekvenciát mutattunk ki, melyek mindegyike az atadenovírus nemzetség ágán foglalt helyet a törzsfarekonstrukción. A nukleotid-sorrendek G+C tartalma 44 és 58% között volt, tehát nem mutatták a genusra eredetileg jellemzınek vélt, magas A+T arányt (Wellehan et al., 2004). Ugyanezzel a PCR eljárással kimutattunk egy új siadenovírust is angliai magángyőjteményekben elhullott ragadozómadarakból, nevezetesen egy Harris ölyvbıl (Parabuteo unicinctus), valamint egy bengáli (Bubo bengalensis) és egy tejuhuból (Bubo lacteus). A kórszövettani vizsgálat során vírus jelenlétére utaló magzárványokat figyeltek meg, azonban a madarak szervmintáiban az egyes baromfifajokban ismert adenovírusokra specifikusnak tartott PCR módszerrel Németországban nem sikerült pozitivitást kimutatni. Egyéb vírusokat sem találtak, ezért küldték a belsı szervek (lép, máj, bél) keverékébıl álló mintákat laboratóriumunkba. A nested PCR mindhárom mintában azonos szekvenciájú DNSszakaszt erısített fel, amely a pulykák vérzéses bélgyulladását (turkey hemorrhagic enteritis) okozó vírus (THEV) rokonának mutatkozott, de a filogenetikai fán attól markánsan elkülönült egy eddig ismeretlen vírusfaj létét jelezve (Zsivanovits et al., 2006). 9

11 Adenovírus-genomok megırzöttsége Az Adenoviridae család elfogadott négy nemzetségének megfelelı fıbb leszármazási vonalak jellegzetes képviselıinek genom-szervezıdését elemezve megállapítottuk, hogy a genom középsı része megırzött, míg a genom-végek szervezıdése a genusokra jellemzı (Benkı & Harrach, 2003). A mastadenovírusok korai régiói közül csak a jobbról balra átíródó szálon kódolt E2 transzkripciós egység található meg valamennyi vizsgált genomban és genusban. A mastadenovírusok E1, E3 és E4 régióinak géntermékei a gazdasejt mőködését, illetve a gazdaszervezet immunválaszát befolyásolják a vírus replikációja és fennmaradása szempontjából elınyös módon. KÉSİI GÉNEK pvii 22K/33K piiia pvi proteáz fiber 52K III px hexon 100K pviii IVa2 pol ptp DBP U exon E2B E2A 1. ábra. Az adenovírusok genomjának középsı része, amelynek tartalma az Adenoviridae család négy ismert (Mastadenovirus, Aviadenovirus, Atadenovirus és Siadenovirus) nemzetségének minden tagjában megırzött. A 22K/33K két, részben átfedı gént jelöl, melyek közül a 33K mrns-e splicing révén jön létre. Az U exon (szürkével jelölve) ritkán hiányzik (pl. a BAdV-10 genomjából). Az NCBI génbankjában az annak idején megtalálható adenovírusból származó, valamennyi teljes genom-szekvenciát újraelemeztük, pontosítottuk és újraértelmeztük a gének, fehérjék leírását (annotációját) (Davison et al., 2003). A teljes genomok összehasonlítása során megerısítettük, hogy a genom középsı részén 16+1 olyan gén található, amelyek vélhetıen a víruscsalád valamennyi tagjában megırzöttek. Ezek között az erısen konzervált (IVa2, DNS-polimeráz, 10

12 ptp, 52K, piiia, III, pvii, px, pvi, hexon, proteáz, DBP, 100K, 22&33K, pviii, fiber) gének között azonban egyetlen olyan nincs, amit az E1, E3 vagy E4 régió kódolna. Megemlíthetı még egy további gén, az U exon, amely általában megırzött, de homológiát csak az egyes genusokon belül mutat (1. ábra). A különbözı BAdV-10 törzsek genom-variációinak azonosítása során külön analízisnek vetettük alá a mastadenovírusokban az E3 és E4 elnevezéső, korai transzkripciós egységekben, illetve a többi nemzetségben ezek helyén található gének számát, és feltételezhetı homológ vagy nem homológ természetét (Ursu et al., 2004). Megerısítettük, hogy a genom-végek szervezıdése általában a nemzetségre jellemzı, ugyanakkor az E3 régió (mely a konvencionális értelmezés szerint a pviii és a fiber gén között elhelyezkedı transzkripciós egység) nagy változatosságot mutat még azonos gazdafaj azonos nemzetségbe tartozó adenovírusai között is. Erre jó példát szolgáltatott a BAdV-10, amelynek E3 régiója feltőnıen egyszerő, mindössze két gént tartalmaz, sıt meglepı módon az E3 szomszédságában, a szemközti szálon kódolt U exon is hiányzik. Hal-adenovírus genomjának elemzése A fehér tok (white sturgeon) adenovírusának (WSAdV-1) genomjából véletlenszerő molekuláris klónozással három szakaszt nyertünk, majd ezek összekötését PCR segítségével hajtottuk végre (Kovács et al., 2003). A teljes hexon és proteáz gén nukleotid-sorrendjét meghatároztuk, és ezeken alapuló filogenetikai elemzéssel megerısítettük, hogy a négy, hivatalosan elfogadott nemzetség mellett ez a vírus egy ötödik, jól elkülönülı leszármazási vonalat képvisel. Javaslatot tettünk egy újabb genus létrehozására, amelynek az Ichtadenovirus nevet ajánlottuk (Benkı et al., 2005). Az új genus jellemzéséhez feltétlenül szükséges lenne a genom-végek nukleotid-sorrendjének meghatározása is. Ezt azonban huzamos ideig hátráltatta az a feltételezésünk, hogy a WSAdV-1 genomja a béka-adenovíruséhoz (FrAdV-1) áll legközelebb, és mérete ahhoz közeli (kb bp) vagy akár annál kisebb is lehet (Davison et al., 2000). Nemrégiben sikerült a fiberrel homológ szekvenciákat tartalmazó, klónozott genom-részletet a korábban közölt (Kovács et al., 2003), kb. 17,5 ezer bp mérető, egybefüggı szekvenciával PCR segítségével összekötnünk. Ez azonban számtalan sikertelen próbálkozás után a várttól eltérıen, az ismert szakasz bal oldalán, a IVa2 génhez csatlakoztatva sikerült. A jelenleg meglévı 11

13 adatok szerint a WSAdV-1 genomjának középsı részén a konzervált gének közül csak 14 található meg, és a pviii valamint az U exon homológját nem sikerült azonosítani. Találtunk viszont két fiber-szerő gént, amelyek a szokásostól eltérı módon a genom bal oldalán, a IVa2 gén elıtt helyezkednek el (2. ábra). Az eddig megismert, 30 ezer bázispárt meghaladó mérető genom-szekvencia jelenlegi bal, illetve jobb végén további 6 (4 teljes és 2 részlegesen ismert szekvenciájú) ORF-t találtunk, amelyek közül némelyiknek nincs még kimutatható, ismert homológja, másikaknak viszont legközelebbi rokonai a génbankban megtalálható szekvenciák közül bakteriofág vagy bakteriális eredetőek (Benkı et al., 2008) aa URF 2 fiber 693 & 405 aa 756 aa URF KÉSİI GÉNEK pvii piiia pvi proteáz 22K/33K 52K III px hexon 100K pviii fiber XX X IVa2 pol ptp DBP U exon E2B E2A 2. ábra. A hal-adenovírus (WSAdV-1) genomjának eddig ismert része. A genomot jelképezı vízszintes vonalon az osztások kb bázispárt jelentenek. Szürke szín jelzi a csak a WSAdV-1-ben talált ORF-eket. MEGVITATÁS ÉS KÖVETKEZTETÉSEK Bovin adenovírusok kimutatása és tipizálása Az egyes gazdafajokból izolált adenovírus típusok gyorsan növı száma miatt napjainkra a hagyományos tipizálási módszerek, nevezetesen az agargélimmundiffúziós és a vírusneutralizációs próbák kivitelezése rendkívül körülményessé vált. Megbízható eredményekhez ugyanis elengedhetetlen lenne, hogy rendelkezzünk a teljes vírus- és specifikus ellenanyag-készlettel. Ez mostanra még a humán egészségügy területén is csak korlátozott számú laboratóriumban áll rendelkezésre. Állatorvosi viszonylatban még ritkább, hogy egy laboratórium valamennyi állatfaj teljes adenovírus prototípus sorozatát a hozzá tartozó 12

14 hiperimmun-savókkal készenlétben tartaná. Ráadásul, amint azt kandidátusi munkámban is tárgyaltam (Benkı, 1990), nem ritkán elıfordul a prototípus törzsek cseréje vagy összekeverése. A vírusneutralizáció kiváltására korábban vizsgálták az ELISA alkalmazásának lehetıségét is, azonban az ehhez szükséges, a szerotípusok megkülönböztetésére alkalmas monoklonális ellenanyagok elıállítására irányuló törekvések sikertelenek maradtak. Ezért a hagyományos savóval végzett immun-hisztokémiai vizsgálatok sem szolgáltatnak pontos adatokat a vizsgált vírus típusára vonatkozóan (Smyth et al., 1986). Feltehetıen az imént vázolt nehézségek is hozzájárultak ahhoz, hogy a legújabb (52-es) HAdV szerotípust közel egy évtizeddel késıbb írták le (Jones et al., 2007), mint az ezt megelızıen utolsó HAdV-50-et és 51-et (DeJong et al., 1999). A BAdV-ok esetében kilenc szerotípust tartottak nyilván közel húsz éven át (Guenov et al., 1971). A BAdV-10 új típusként való közlése a törzs eredeti izolálása (Horner et al., 1980) után majdnem 10 évvel, már DNS-analízissel alátámasztott, és nem szerológiai vizsgálatok alapján történt (Horner et al. 1989). Biológiai tulajdonságai inkább a 2. alcsoportba tartozónak tőntették fel a vírust, de késıbb a genom térképezése (Matiz et al., 1996) és szekvenálása egyértelmően bizonyította, hogy a Mastadenovirus genusba sorolható (Matiz et al., 1998), jóllehet a filogenetikai fán a másik négy mastadenovírus BAdV-tól (BAdV-1, -2, -3 és -9) távol helyezkedik el. Ennek köszönhetıen, és a Southern-blot hibridizációs kísérletek (Benkı et al., 1995) eredményeivel tökéletes összhangban, az in situ hibridizálás során a BAdV-10 nem adott keresztreakciót az ismert BAdV-okkal. Kandidátusi munkám egyik részeredményeként a Ruakura törzset BAdV-10 néven új típusnak javasoltuk (Horner et al., 1989). Az eredetileg Új-Zélandon izolált vírust (Horner et al., 1988) hamarosan európai szarvasmarhákban is megtalálták sporadikus elhullások során. Az izolálás 4 esetben volt eredményes. A törzsek genomjának restrikciós enzimes analízise az átlagosnál rövidebb, és variábilis DNSt mutatott. Egy PHARE ACCORD pályázat támogatásával olyan molekuláris biológiai diagnosztikai eljárást dolgoztunk ki, amellyel kórszövettani vizsgálatra készült, archivált paraffinos blokkokból származó metszeteken retrospektív vizsgálatokat is el lehetett végezni. Ennek segítségével kiderült, hogy a BAdV-10, vagy ahhoz genetikailag nagyon közel álló vírus, hasonló, véres-fibrines bélgyulladással és elhullással járó megbetegedést Észak-Írországon kívül más európai országban és Kanadában okozott már (Smyth et al., 1999). Kimutattuk 13

15 továbbá, hogy ilyen kórképet a BAdV-4 (és elképzelhetı, hogy a többi bovin atadenovírus is) elıidézhet, míg mastadenovírusokhoz tartozó BAdV típust egyetlen esetben sem detektátunk. Olasz együttmőködésben vizsgált, hasonló kórbonctani képpel járó esetben a BAdV-4 próbával kaptunk pozitív reakciót (Giusti et al., 1998). Ezen kívül Kaliforniában során feltehetıen több ezer öszvérszarvas (Odocoileus hemionus) elhullásával járó járványból származó kórszövettani minták vizsgálata szintén csak a BAdV-4-es próbával adott pozitív hibridizációt (Smyth & Benkı, nem publikált eredmények). A kórokozót feltehetıleg a PCR során bekövetkezett kontamináció miatt elıször tévesen, a BAdV-3-mal azonos vírusként írták le (Lapointe et al., 1999). Az elhullott öszvérszarvasokban testszerte, de elsısorban az emésztı csatornában megfigyelhetı, erıs vérzések miatt mi a BAdV-10 kóroktani szerepére gyanakodtunk. A késıbb elvégzett DNS-térképezés és -szekvenálás végül egy új atadenovírus felfedezéséhez vezetett (Zakhartchouk et al., 2002), tehát jogos volt a BAdV-4 próbánkkal kapott pozitív reakció. Összegezve a fenti eredményeket megállapíthatjuk, hogy elhullással járó betegségek kapcsán egyrészt az atadenovírusok, az ismert mastadenovírus BAdVok közül pedig csak BAdV-10 kórokozó szerepét tudtuk kimutatni. Feltételezésünk szerint az atadenovírusok elıfordulása a kérıdzıkben gazdaváltás eredménye, ami járhat a vírus fokozott patogenitásával. A BAdV-10 filogenetikai helye alapján szintén nem tekinthetı valódi szarvasmarha-vírusnak, és talán épp emiatt ugyancsak emelkedett lehet kórokozó képessége. Adenovírusok kimutatása PCR segítségével A DNS-szekvenálás technikájának egyszerősödésével és terjedésével a specifikus víruskimutatásban a PCR és szekvencia-analízis fokozatosan egyre nagyobb teret nyer. Az 1983-ban feltalált PCR alkalmazásáról svédországi tanulmányútjaimnak köszönhetıen már 1990-ben készült kandidátusi értekezésemben beszámolhattam. Laboratóriumunk elsı PhD hallgatói, akik úttörı szerepet játszottak e technika bevezetésében és az elsı PCR laboratóriumok létesítésében a hazai állatorvosi diagnosztikai hálózatban (a debreceni, majd az Országos Állategészségügyi Intézetben), az adenovírusok kimutatásán és vizsgálatán keresztül ismerték meg és sajátították el a molekuláris biológia modern módszereit. 14

16 Kezdetben a hexon génre irányuló, és mindössze 300 bp mérető terméket eredményezı PCR-t használtunk (Benkı, 1990; Kiss et al., 1996a). A szekvenálással és filogenetikai analízissel kombinált PCR módszert többek között sikerrel alkalmaztuk Angliában elhullott közönséges erdeimókusok (Sciurus vulgaris) mintáiban egy új típusú, a filogenetikai távolság alapján új fajt is képviselı adenovírus kimutatására (Sainsbury et al., 2001). Az atadenovírusok specifikus vizsgálatára tervezett, érzékenyebb PCR-t biztosító primerek a hexon gén egy hosszabb (600 bp) szakaszának kinyerését tették lehetıvé (Dán, 2001). Ezt a PCR módszert hazai baromfitelepen kislibák elhullásával járó megbetegedésbıl izolált vírus, valamint a kísérletesen fertızött madarak szervmintáinak vizsgálatára is használtuk. A PCR termék szekvenciája és a vírus-dns restrikciós enzimes analízise alapján a kórokozót EDS (egg drop syndrome) vírusként határoztuk meg (Ivanics et al., 2001). A módszert késıbb Észak-Írországban elhullott borjú emésztıtraktusából izolált vírus jellemzésére is igénybe vettük (Graham et al., 2005). A PCR termék szekvenciájának meghatározása alapján megállapítottuk, hogy az a BAdV-6-tal csaknem teljesen azonos, és ezt az izolált vírus genomjának restrikciós enzimes analízisével is megerısítettük (Benkı et al., 1988) Idıközben a baromfiban elıforduló adenovírusok azonosítására alkalmas több PCR módszert publikáltak. Ezek némelyikét a 12 tyúk-adenovírus szerotípus kimutatására ajánlották (Raue & Hess, 1998; Meulemans et al., 2001), de felismerték már azt is, hogy az atadenovírusok közé tartozó EDS vírus (Raue & Hess, 1998; Hess, 2000), valamint a siadenovírus THEV (Hess et al., 1999) detektálásához specifikus primerek szükségesek. A leírt primereket és módszereket laboratóriumunkban tesztelve értékeltük azok alkalmazhatóságát és hatékonyságát (Papp et al., 2001), azonban a kígyó- és hal-adenovírus felismeréséhez egyik eljárás sem bizonyult használhatónak. A teljes szekvenciák egyre gyarapodó számának köszönhetıen már a négy ismert leszármazási vonalnak (Davison et al., 2000) megfelelı csoportok tagjainak genomját hasonlíthattuk a PCR számára ideális célpontot jelentı génszakaszok keresése céljából. Így esett választásunk a DNS-függı DNS-polimeráz fehérjének legjobban megırzött aminosav motívumaira, amelyekre erısen degenerált primereket terveztünk. Ezek segítségével sikerült a világon elsıként nukleotidsorrendet meghatároznunk hüllıbıl és halból izolált adenovírusokból (Benkı et al., 2002). A nyert szekvenciából származtatott aminosav-sorrend rövidsége ellenére is 15

17 alkalmas alapnak bizonyult filogenetikai számítások elvégzéséhez. A törzsfarekonstrukción a kígyó-adenovírus az atadenovírusokkal egy ágra került, míg a tokhal-adenovírus várakozásainknak megfelelıen önálló ágat képviselt. Az atadenovírusok eredete után nyomozva (Benkı, 1999), alapvetıen elméleti szempontból kezdtünk a hüllık adenovírusai iránt érdeklıdni, de épp ebben az idıszakban a kedvencként tartott hüllık száma is jelentıs növekedésnek indult, elıbb Észak-Amerikában, majd Európában és hazánkban is. Gyakorlati igény jelentkezett a népszerőbb fajok, így elsısorban a szakállas agáma (Pogona vittceps), de egyéb gyíkfajok valamint kígyók esetleges vírusos fertızéseinek illetve betegségeinek felismerésére. A virális DNS-polimeráz génre irányuló PCR nested változatának kidolgozása ugrásszerő növekedést eredményezett annak érzékenységében, így alkalmas lett a vizsgálati mintákban esetleg csak alacsony kópiaszámban jelenlévı adenovírusok kimutatására is. Hat új, hüllı eredető atadenovírus típust írtunk le (Wellehan et al., 2004), melyeket a jövıben további részletes vizsgálatnak vetünk alá. A törzsfa-rekonstrukció szerint mind a hat vírus az atadenovírusok csoportjába, de a kérıdzık atadenovírusaitól elkülönülı ágon foglal helyet. Ez a nested PCR laboratóriumunkban az adenovírusra történı szőrés elsıdleges eszköze lett, és fıként madár eredető mintákon igen eredményesen használjuk. Eddig a tesztelésre rendelkezésre álló összes ismert adenovírust detektálta. Véletlenszerően győjtött minták közül a vadmadár eredetőekben mintegy 10% körüli pozitivitást találunk, de sikerült néhány, elıreláthatólag új mastadenovírus kimutatása is például szarvasmarhából és fıemlısökbıl (nem közölt eredmények). Különösen hasznosnak bizonyult a módszer az Angliában elhullott ragadozómadarak mintáinak vizsgálatakor, mert ebben az esetben a baromfiadenovírusokra korábban kidolgozott valamennyi PCR (Hess, 2000) negatív eredményt adott, nekünk viszont sikerült egy új siadenovírus kimutatása (Zsivanovits et al., 2006). Az elpusztult madarak belsı szerveibıl a vírus izolálására tett kísérletek ugyan nem jártak eredménnyel, a mintákon végzett PCR segítségével mostanra csaknem az egész genom nukleotid-sorrendjét sikerült meghatározni egy PhD munka keretében (Kovács & Benkı, 2009). A THEV különbözı kórformákból (pulykák vérzéses hasmenése, fácánok márványlép betegsége, csirkék splenomegáliája) izolált törzsei között sem szerológiai, sem 16

18 jelentékeny genetikai eltéréseket nem tudtak kimutatni. A ragadozómadarakban detektált siadenovírus viszont egy új faj kialakításának kritériumait kielégítı genetikai távolságot mutat, és felismerése szignifikánsan, kettırıl háromra növelte a korábban alulreprezentált Siadenovirus genus tagjainak a számát. Adenovírus genomok összehasonlító vizsgálata A legkorábban kérıdzıkben (úgynevezett 2. alcsoportbeli BAdV-ok, OAdV-7), majd a madarakban (EDS vírus) is felismert atadenovírusok eredete utáni nyomozás során e kivételnek számító vírusoknak a Mastadenovirus és Aviadenovirus genus nem rendhagyó tagjaitól mért filogenetikai távolsága alapján Harrach (2000) feltételezte, hogy ezek talán egy ısibb gerinces osztállyal, legvalószínőbben a hüllıkkel együtt fejlıdött adenovírus leszármazási vonalat képviselik. Az elsı hallásra bizarrnak tőnı hipotézis megerısítése vagy esetleges megcáfolása céljával kezdtünk az alacsonyabb rendő gerincesek meglehetısen gyér számban ismert adenovírusainak genetikai tanulmányozásába. Az egyetlen békából izolált adenovírus törzs meglepı módon, a genom-szerkezeti egyedisége miatt az aviadenovírusok úgynevezett II. csoportjából már eltávolításra javasolt pulykaadenovírussal (THEV) mutatott világosan felismerhetı genetikai rokonságot. E két vírus, melyek besorolására a Siadenovirus nemzetség létrehozását javasolták (Davison és Harrach, 2002), genom-méret és -szervezıdés tekintetében napjainkig is a minimumot képviselik az Adenoviridae családon belül (Benkı & Harrach, 2003). A gabonasikló adenovírusából (SnAdV-1) nyert elsı szekvenciák filogenetikai analízise jelezte (Benkı et al., 2002; Farkas et al., 2002), hogy ez a vírus csakugyan az atadenovírusok közeli rokona. Amikor a SnAdV-1 teljes nukleotidsorrendjét meghatároztuk (Farkas et al., 2008), megállapíthattuk, hogy genomszervezıdés szempontjából is a korábban vizsgált atadenovírusokkal azonos csoportba sorolható. E genomok két végén elhelyezkedı, úgynevezett LH és RH régiókban található jellegzetes gének, valamint a p32k protein génje (Both, 2002) mind a madár (EDS vírus), mind pedig a kérıdzı eredető (BAdV-4, BAdV-6, Rus törzs és OAdV-7) atadenovírusokban elıfordulnak, és homológjaikat azonosítottuk a SnAdV-1-ben is. A duplikálódott illetve multiplikálódott gének azonban a SnAdV-1 genomjában esetenként csak egy példányban vannak jelen e vírus feltehetıen 17

19 ısibb voltára utalva. Ellentétben a genus elnevezésével a SnAdV-1 genom G+C tartalma 50,2%. Összehasonlítási célból vizsgáljuk több kérıdzıbıl származó atadenovírus teljes genomját is. E témában eddig két PhD értekezés született a BAdV-4 (Dán, 2001) és a BAdV-11-nek javasolt Rus törzs (Élı, 2002) elemzésébıl. A BAdV-6-ról most van készülıben egy harmadik PhD munka, amelynek kísérleti része már befejezıdött. Valamennyi elemzett genom szervezıdése megerısíti a genusra jellegzetes LH és RH régiók meglétét és a bennük kódolt fehérjék homológ voltát (Both, 2002). A SnAdV-1 genomban felismert kiegyensúlyozott G+C arány kezdetben meglepetést okozott, de a gyík-adenovírusok jóllehet egyelıre rövid, ismert szekvenciáiban ugyanezt az arányt találtuk. Mivel jelenlegi hipotézisünk szerint az atadenovírusokat a hüllıkkel, ezen belül pontosabban a pikkelyes hüllık (Squamata) rendjével (kígyókkal és gyíkokkal) együtt fejlıdött leszármazási vonalnak tartjuk, a kérıdzıkben, egy erszényesben (Thomson et al., 2001) és madárban (EDS vírus) való elıfordulásukat gazdaváltás következményének feltételezzük (Benkı & Harrach, 2003). A kiegyensúlyozottnak tekintett (45-55%) aránytól eltérı alacsony G+C tartalom ezekben a feltételezett gazdaváltáson átesett vírusokban talán az új gazdához való adaptáció kísérıjelensége lehet. A fenti spekuláció esetleges helytállóságát erısíti a BAdV-10 DNS-ének viszonylag alacsony (<41%) G+C tartalma is (Ursu et al., 2004). A törzsfa-rekonstrukción elfoglalt helye alapján ugyanis a BAdV-10 a rágcsálók adenovírusaihoz áll legközelebb, tehát feltételezhetı, hogy nemrégiben jutott át szarvasmarhába. Alátámaszthatja ezt a feltételezést a BAdV-10 viszonylag nagyfokú kórokozó képessége (eddig minden izolátuma elhullott állatból származik), és genomjának a fiber gén környékét érintı törzsenkénti variálódása (deléció, reiteráció) ugyancsak egy jelenleg is folyamatban lévı adaptációs folyamat jele lehet (Belák et al., 1986; Shayakhmetov & Lieber, 2000; Szendrıi et al., 2003). A hal-adenovírus genom szekvenciájának meghatározása és elemzése A hal-adenovírus teljes genom-szekvenciájának meghatározását célzó témánk a tervezettnél lassabban halad. A vírus gyenge replikációs képessége miatt a szövettenyészetben elérhetı vírustiter alacsony, ami meghiúsította a HAdV-oknál szokásos egyensúlyi grádiens centrifugálással történı tisztítást. Ráadásul a 18

20 sejttenyészetben feltehetıleg konkurens ureaplasma fertızöttség is fennállt, így a kivont genomiális DNS véletlenszerő molekuláris klónozása számos, a BLAST alapján nem virális eredető fragmentum beépülését eredményezte. A DNSpolimeráz génbıl nyert rövid PCR termék, valamint három, egyértelmően azonosítható klón szekvenciája alapján tervezett PCR-ekkel sikerült a genom középsı részét tartalmazó, kb. 17,5 ezer bp, egybefüggı szakasz nukleotidsorrendjét meghatározni (Kovács et al., 2003). Az, hogy a WSAdV-1 egy nemzetség szinten elkülönülı csoport tagja, már a kezdeti (hexon és proteáz szekvencián alapuló) filogenetikai számítások eredményei mutatták. Ezért javaslatot tettünk egy ötödik genus létrehozására, és az ICTV 8. Jelentésében található törzsfa-rekonstrukción a WSAdV-1 már az új, Ichtadenovirus ajánlott névvel jelölt, javasolt genusban szerepel (Benkı et al., 2005). Az ismert szakasz két végére tervezett, specifikus primerekkel egykarú PCReket hajtottunk végre, hogy a SnAdV-1 esetén alkalmazott eljárással (Farkas, 2005) nyerjük ki a genom-végeket. Az egyféle primerrel kivitelezett PCR-ek egy részében mégis kétszálú, specifikus termék keletkezett, ha a primer a vírus-genom egy távolabbi szakaszán a komplementer szálon is tapadni tudott. (Hasonló jelenséget a raptor adenovírus szekvenálása során is tapasztaltunk.) Ezzel, az elıre nehezen tervezhetı, stratégiával sikerült WSAdV-1-bıl mostanra 30 ezer bp feletti szekvenciát összeállítanunk. Azonban a nemzetség jellemzése szempontjából legizgalmasabb genom-végek genetikai tartalmának teljes megismerése még várat magára. A 2. ábrán bemutatott, jelenleg birtokunkban lévı genom-szekvencia bal oldalán talált, bakteriális vagy bakteriofág eredető fehérjékkel homológiát mutató ORF-ek felvetik a korábban (egyértelmően bakteriálisnak tőnı eredetük miatt) kiselejtezett klónok újravizsgálatának szükségességét. Mindazonáltal az eddig megfigyelt sajátosságok, mint például a pviii gén látszólagos hiánya, vagy a genom bal oldalán elhelyezkedı, feltehetıen duplikálódott fiber gén a többi genus között feltárt különbségekhez képest a genom-szervezıdés jelentısebb eltérésére utal. Itt szeretnék egy rövid kitérıben analógiát vonni az ugyancsak közepes mérető, duplaszálú DNS-genommal rendelkezı, és így az adenovírusokhoz több tekintetben hasonlítható herpeszvírusokkal. A hagyományos Herpesviridae családba az emlısök és madarak herpeszvírusain kívül a hüllık herpeszvírusai is egyértelmően besorolhatónak bizonyultak, mégpedig az összes madárherpeszvírust is tartalmazó Alphaherpesvirinae alcsaládba (Marschang et al., 2006; 19

21 Stacy et al., 2008). Ugyanakkor a halakból és kétéltőekbıl izolált herpeszvírusok mind nukleotid-sorrendjük, mind génkészletük alapján olyan mértékben különböznek a hüllı, madár és emlıs eredető herpeszvírusoktól, ami közvetlen összehasonlításukat gyakorlatilag meghiúsítja. A saját kutatási eredményeink által is megtámogatott (Doszpoly et al., 2008), nemrégiben bevezetett rendszertani változások szerint két új családot, és a családok együvé tartozásának kifejezésére egy új rendet (Herpesvirales) alapítottak ( Az egyik új családot (Malacoherpesviridae) az egyes kagylófajokban elıforduló herpeszvírusok besorolására hozták létre. A másik új család (Alloherpesviridae) tagjait halakból vagy kétéltőekbıl izolálták. Érdekes módon az alloherpeszvírusok között néhány, kiemelkedıen nagy és komplex genommal rendelkezı hal- és béka-herpeszvírus található. Tehát megállapíthatjuk, hogy a herpeszvírusok esetében az emlısök, madarak és hüllık vírusai közelebbi rokonságban állnak egymással, mint a kétéltőek és halak herpeszvírusaival, amelyek család szinten elkülönülnek. Jelenleg mindössze egyetlen békából izolált adenovírust ismerünk. E vírus jellegzetességei alapján feltételezzük, hogy a Siadenovirus genus a kétéltőekkel együtt fejlıdött leszármazási vonal (Davison et al., 2003), és a THEV gazdaváltáson esett át. Újabban azonban egyre több vadmadár mintájában mutatunk ki siadenovírus-szerő szekvenciákat, sıt hasonlót egy esetben egy szárazföldi teknısben is találtak (Wellehan, személyes közlés). A laboratóriumunkban jelenleg folyó szőrıvizsgálatok bíztató eredményei további egzotikus gazdafajokban különleges adenovírusok felismerését vetítik elıre. Ha a Siadenovirus genusról kiderülne, hogy nem a kétéltőekkel együtt fejlıdött adenovírus vonalnak felel meg (amit az eddig ismert valamennyi siadenovírus szekvencia alacsony G+C tartalma is jelezhet), akár az is elképzelhetı, hogy a halés valódi kétéltő-adenovírusok, a hal- és béka-herpeszvírusokhoz hasonlóan, nagyobb távolsággal különülnek el a hüllık, illetve ezeknél magasabb rendő gazdák adenovírusaitól. Mindenesetre érdekes, hogy a hal-adenovírus genomja a várt 26 ezer bp körülinél máris jóval nagyobbnak mutatkozik. Taxonómiai javaslatok A jelen téziseimben összefoglalt munkáink legnagyobb nemzetközi hatása az adenovírusok rendszertanának átfogó megújítása volt. Ennek szükségszerőségére eredetileg a szarvasmarha-adenovírusok összehasonlítása során tapasztalt jelentıs 20

22 eltérések hívták fel a figyelmünket. Elsı hivatalos taxonómiai javaslatunk (Benkı & Harrach, 1998), amit hosszú és megmagyarázhatatlan csatározások után az ICTV csak 2002-ben hagyott jóvá (Benkı, 1999; Mayo, 2002) az Atadenovirus genus létrehozására vonatkozott. Mivel az adenovírusok rendszertani leírásának aktualizálása ekkor már évek óta elmaradásban volt, 1999-ben megbíztak az ICTV 7. Jelentéséhez az Adenoviridae fejezet szerkesztésével, és az Adenoviridae Munkacsoport vezetésével is. Az ICTV akkori követelményének megfelelıen, javaslatunk alapján alakították ki az adenovírus species (vírusfaj) definícióját és demarkációs kritériumait (Benkı et al., 2000). Az új taxon gyakorlati hasznának és használhatóságának azóta már közel évtizedes tapasztalatai vannak, és széleskörő elfogadtatásán folyamatosan munkálkodunk. A gazdafaj nevével és az ABC betőivel jelzett adenovírus-fajok általában több, genetikailag szoros rokonságban álló szerotípust foglalnak magukban. A humán és állati adenovírusok kiterjedt szekvencia-analízise az így meghatározott fajokon belül számos rekombináns létezését tárta fel. A szerológiai adatok hiányában vagy ellentmondásos szerológiai eredmények esetén praktikus megoldásnak látszik a típus helyett csak a faj meghatározására szorítkozni. A gyakorlatban ennek alkalmazását elsısorban a baromfi-adenovírusok tipizálása során figyelhettük meg (Ojkic et al., 2008a & b), de fokozatosan a HAdV-okkal kapcsolatos szakirodalomban is elterjedt az új nevezéktan. A téma folytatása Mint a bevezetıben már említettem, az adenovírusok hihetetlen sokféleségének feltárása még épp csak elkezdıdött, emiatt jelenlegi rendszertani beosztásuk sem tekinthetı véglegesnek. Laboratóriumunkban tucatnyi lelkes fiatal (doktorandusz és szakdolgozatot készítı hallgató) vesz részt az izgalmas adenovírus-vadászatban. A fentiekben leírt nested PCR módszer rendkívüli érzékenységét a specificitás rovására lehetett elérni, tehát nem is ritkán elıfordul, hogy nem megfelelı mérető termékek (is) keletkeznek, vagy a várt, 300 bp mérető PCR termékrıl a szekvenálás után derül ki, hogy nem specifikus. Legnagyobb számban vadmadár mintákat vizsgálunk, és ezekben a siadenovírusokéhoz hasonló számban új atadenovírusok is kimutathatók. Ez a megfigyelés beleillik a madarakat is hüllınek tekintı korszerő állatrendszertan koncepciójába. Elképzelhetı, hogy a siadenovírusok valamilyen, a pikkelyes 21

23 hüllıktıl eltérı ággal, például a teknısökkel fejlıdtek együtt. Megjegyzendı, hogy épp teknısökben egy az eddig ismert szekvenciáktól jelentısen eltérı, egyelıre új vonalat képviselı adenovírust is találtunk a nested PCR alkalmazásával. A koevolúcióra vonatkozó elmélet alátámasztásához olyan állatok mintáinak beszerzésére és vizsgálatára törekszünk, amelyekbıl pillanatnyilag ismert adenovírus egyáltalán nem, vagy nagyon korlátozott számban áll rendelkezésünkre. Ilyenek többek között a kétéltőek, teknısök, rágcsálók, újvilági majmok. Azt reméljük, hogy az egyre bıvülı gazdaspektrumból származó adenovírusok megismerésével elıbb-utóbb mélyebb összefüggések pontosabb feltárására nyílik majd lehetıségünk, és talán épp az egzotikus vadállatok adenovírusainak vizsgálata fog rávilágítani a gerincesek törzsfejlıdésének néhány még vitatott kérdésére. Például, a 169 madárfajt besoroló, legújabb madár rendszertant (Hackett et al., 2008), ami már mintegy 32 ezer bp mennyiségő kromoszomális szekvencia összehasonlításán alapul, nagyon jól megerısíti az általunk egyes madárfajokban talált aviadenovírusok egyelıre csak rövid szakaszának szekvenciája alapján készített törzsfa hasonló topológiája. A vadállatokban és madarakban esetleg gyakran elıforduló, eddig ismeretlen adenovírusok jellemzésének gyakorlati szempontból is jelentısége lehet, mert elképzelhetı, hogy baromfiba vagy más gazdasági állatokba kerülésük esetén súlyos veszteségeket okozó megbetegedést idéznek elı. Ilyen esetekre felkészülni nem nagyon lehet, de legalább a vírus kimutatásának képességével rendelkezünk. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Szakmai pályafutásom során mindenkor önzetlen, odaadó munkatársak és családtagok vettek körül, akik közül sajnos többen már nincsenek ezen a világon. Ezúton szeretném kifejezni szívbıl jıvı köszönetemet Mindenkinek az eddig kapott sok segítségért, támogatásért, gondoskodásért, türelemért és szeretetért, és mindezekért hálával tartozom a Gondviselésnek is. 22