LEPTIN, LEPTINRECEPTOR ÉS EGYÉB ADIPOKINEK VIZSGÁLATA HISZTIDIN- DEKARBOXILÁZ GÉNKIÜTÖTT EGÉRBEN

Átírás

1 LEPTIN, LEPTINRECEPTOR ÉS EGYÉB ADIPOKINEK VIZSGÁLATA HISZTIDIN- DEKARBOXILÁZ GÉNKIÜTÖTT EGÉRBEN Hegyi Krisztina Doktori (PhD) értekezés Készült a Semmelweis Egyetem Molekuláris orvostudományok Tudományági Doktori Iskola A humán genetika és géndiagnosztika alapjai c. Ph.D. program keretében Program- és témavezeto: Dr. Falus András egyetemi tanár Szigorlati bizottság: Dr. Schaff Zsuzsanna, egyetemi tanár, SE II. Patológiai Intézet elnök Dr. Váradi András, tudományos tanácsadó, Enzimológiai Intézet Dr. Vásárhelyi Barna, tudományos fomunkatárs, SE I. Gyermekgyógyászati Klinika Bírálók: Dr. Rácz Károly, egyetemi tanár, SE II. Belgyógyászati Klinika Dr. Sarkadi Lívia, egyetemi docens, BMGE Biokémiai és Élelmiszertechnológiai Tanszék Budapest, 2004.

2 Az Úr esztendeje március havának 31. napján Cambridge városában, a Corpus Christi College diákjaként kezdem el írni a PhD dolgozatomat. Isten kegyelme legyen velem, hogy összefogott, bölcs dolgozatot írhassak az O dicso ségére, bizonyságot téve az O hatalmas erejéro l, bölcsességérol, amellyel engem vezetett, hogy erre a témára rátaláljak, az ötletbol terv születhessen, a kísérletek sikerrel járhassanak, és végül hogy megírhassam a dolgozatot. Istennek legyen dicsoség és hála! Köszönöm mindenható Atyám a segítségedet. 2

3 TARTALOMJEGYZÉK Tartalomjegyzék... 3 Bevezetés... 4 Irodalmi áttekintés... 5 A leptin molekula... 5 A leptin receptora (OBR), jelátviteli utak... 9 A leptin hatásai Zsírszövet: a fibroblasztszeru sejtektol az endokrin szervig A leptin-hisztamin kapcsolat Hisztidin-dekarboxiláz génkiütött egérmodell Célkituzések A leptinszint jellemzése Egyéb adipokinek vizsgálata A zsírdifferenciálódás vizsgálata Módszerek Eredmények Megbeszélés Következtetések Összefoglalás...83 Abstract Rövidítések Köszönetnyilvánítás Irodalomjegyzék Közlemények

4 BEVEZETÉS Az elmúlt évtizedekben elsosorban a fejlett ipari társadalmakban gyors ütemben nott a túlsúlyosak száma, gyakoribb lett a cukorbetegség, és népbetegséggé vált a csontritkulás. A Egyesült Államok felnott lakosságának 59 százaléka túlsúlyos, kövér vagy extrém módon elhízott, a cukorbetegek 79 százalékának nagyobb a testtömegindexe a normálisnál. Az elhízással kapcsolatos egészségügyi költségek 2002-ben 92,6 milliárd dollárt emésztettek fel, a teljes összeg 9,1%-át. A cukorbetegek száma 1980 és 2002 között megkétszerezodött (5,8-tól 13,3 millióra nott). Az 50 év feletti amerikaiak 55 százalékát veszélyezteti a csontritkulás, az oszteoporózisra visszavezetheto csonttörések miatti kiadások meghaladták az évi 17 milliárd dollárt (1). A leptin az energiahomeosztázis egyik legfontosabb szabályozója, olyan központi elem, amely kapcsolatot teremt a zsírszövet mint energiaraktár és a metabolikus folyamatok között. A testtömeg indikátora, rendellenes muködése, hiánya súlyos zavart okoz a táplálékfelvételben, az energiaraktározásban és felhasználásban. A leptin hatásait endokrin, parakrin módon fejti ki, számos szabályozó folyamatot köt össze a zsírszövettel. A leptin érintett mind az elhízás, mind a diabétesz, mind pedig a csontritkulás kórtanában, így hatásmechanizmusának, szabályozó folyamatainak pontos felderítése alapveto. A leptin hatásainak egyik közvetítoje a hisztamin, elsosorban a táplálékfelvételre gyakorolt hatása révén. A leptin a hipotalamikus neurotranszmitter hisztamin segítségével csökkenti a táplálékfelvételt és fokozza az energialeadást. Dolgozatom tárgya a leptin és a hisztamin kapcsolatának jellemzése hisztaminhiányos, hisztidin-dekarboxiláz génkiütött egérmodell tanulmányozásával. A krónikus, egész élettartamot átfogó hisztaminhiány pontosabb képet adhat a hisztamin leptinre gyakorolt hatásairól. Munkámban részint a hisztaminhiányos egerek leptin fenotípusát jellemeztem az életkor és a nem szempontjából, másrészt vizsgáltam a megfigyelt módosulások lehetséges molekuláris magyarázatát és annak következményeit a testtömeg és a jelátvitel szintjén. Emellett vizsgáltam, hogy a hisztamin hiányának van-e befolyása egyéb adipokinek termelodésére, továbbá egy mások által eddig még nem kutatott területet, a hisztamin és a zsírsejt-differenciálódás lehetséges kapcsolatát is tanulmányoztam. 4

5 IRODALMI ÁTTEKINTÉS A leptin molekula Ugyan a leptin molekulát éppen 10 éve fedezték fel, létezését már korábban, az 1950-es évektol fogva sejtették. Eloször Kennedy vázolt egy homeosztatikus mechanizmust, amely az energiaraktárak változásait figyelemmel kísérve egy beállított értéken tartja a zsírmennyiséget, a táplálékfelvétel és az energia- felhasználás szabályozásával (2). Modellje összhangban volt más megfigyelésekkel, miszerint a sebészeti zsíreltávolítás hiperfágiát eredményezett (3), illetve az eroltetett táplálékfelvétel miatt bekövetkezett súlygyarapodás csökkentette az önkéntes táplálkozást (4). A ventromediális hipotalamusz léziója miatt elhízott patkányok keringésének összekapcsolása kontroll egyedekkel az utóbbiak halálához vezettek, a patkányok szó szerint halálra éheztek. Ez a kísérlet vetette fel egy keringési faktor lehetoségét, amit akkoriban jóllakottsági faktorként emlegettek (5). A molekula létezését sugallták az akkoriban felfedezett egértörzsek is, amelyek homozigóta mutáns alléljeiknek köszönhetoen súlyosan elhízottak voltak (6, 7). Az obezitás, elhízás szóra utaló ob/ob elnevezésu egértörzs keringését összekapcsolva a vad típusúval, fogyást tapasztaltak a mutációt hordozókban (8), míg ugyanez a kísérlet a másik elhízott, diabéteszes db/db törzs esetében a vad típusú egerek halálra éhezését eredményezte. A két elhízott egér keringésének keresztezésével az ob/ob fogyásnak indult, a db/db nem (8). A fentiek alapján kezdte meg Friedman munkatársaival a nyomozást az elhízást okozó mutáció után. Saját bevallása szerint nyolc éven át kereste a leptin molekulát, amelynek létezésérol meg volt gyozodve, noha azok az évek meglehetosen terméketlenek voltak a számára. Végül 1994-ben a Nature címlapon adta hírül az egér obese gént klónozását és humán megfelelojének azonosítását (9). Az újonnan klónozott gén termékének kristályszerkezetét egy másik munkacsoport közölte 1997-ben (10). Az elnevezés, leptin a görög leptos szóból ered, jelentése vékony, utalva arra a korábbi elképzelésre, miszerint a molekula elsodleges feladata a kövérség megelozése. Az elso közlemények valóban a leptin táplálékfelvételben és energiaegyensúlyban játszott szerepérol szóltak, de a kép 5

6 hamarosan árnyaltabbá vált, és ma már nemcsak a lipid metabolizmusban központi hatású, de sok egyéb funkcióval is bíró molekulaként tartják számon. A leptin gén A klasszikus keresztezési kísérletek alapján Friedman és munkacsoportja az ob gént az egér 6-os kromoszómáján, a Pax4 és a Ptn lókuszok között lokalizálta, majd pozícionális klónozási stratégiát alkalmaztak. Egy 4,5 kilóbázis hosszúságú mrns átiratot találtak, erosen konzervatív 167-aminosavnyi nyitott leolvasási kerettel, amely egyedinek bizonyult a GenBank adatbázisában. Késobb azonosították 10.5 cm pozícióban az ob gént. Emberben ugyanez a gén a 7-es kromoszóma 7q31.3 régióban található, míg patkányban a 4-es kromoszómán (9). Az ob gén 3 exonból és 2 intronból áll, a kódoló régió a 2-es és 3-as exonokban van. A gén és annak promóter régiója tanulmányozásakor CREB, SP-1, C/EBP és GR reszponzív elemeket azonosítottak. A hozzájuk kötodo transzkripciós faktorok a zsíranyagcsere szabályozásában jól ismertek, ugyanakkor nem kizárt, hogy további kötohelyek is részt vesznek a zsírmennyiség vagy az energia-egyensúly megváltozása által okozott expresszió-változásban (11). Az ob génnek két mutációját azonosították egérben, mindketto korán kialakuló extrém kövérséget okoz (9, 12). A mutációt hordozó egerek falánkak, csökkent testhomérsékletuek és számos anyagcsere és neuroendokrin rendellenességben szenvednek. Megnövekedett kortizol és inzulinszintet mértek bennük, hiperglikémiásak, rendellenes a hossznövekedésük, hipogonadális hipogonádizmus következtében sterilek. A C57B1/6J ob/ob egérben szubsztitúció következtében egy cisztein treoninra cserélodik, ezért a 105-ös pozícióban stop kodon lesz arginin helyett. Az így keletkezo csonka polipeptid nem tud szecernálódni, ezáltal szisztémás hipoleptinémia lép fel, ami súlyos elhízáshoz vezet. Ezekben az egerekben a leptin mrns expresszió fokozott, összhangban azzal a megfigyeléssel, hogy a leptin gén expressziója negatív visszacsatolással szabályozott. A másik, ún. ob 2J /ob 2J mutációt hordozó egerekben egy transzpozon illeszkedik a gén 1-es exonjába, megakadályozva ezzel az érett mrns szintézisét, tehát ezesetben protein átirat nem is készül. 6

7 Emberben az ob gén mutációjából eredo súlyos problémák nagyon ritkák, eddig mindössze két esetet írtak le. Eloször két pakisztáni származású brit unokatestvérnél fedeztek fel a morbid elhízás hátterében leptin mutációt (13). Itt a 133-as kodon egyik guaninja deletált, ami kereteltolódáshoz vezetett, így a natív polipeptidben korai stop kodon keletkezett, amely valószínuleg ilyen formában nem tud szecernálódni. A mutációval együtt járó tünetek sokban hasonlítanak az ob/ob egerekére. A gyerekek csecsemoként falánkabbak voltak testvéreiknél, folyamatosan éhesek voltak és ételt követeltek. Miután a gyerekek még a pubertás elott vannak, az egereknél tapasztalt sterilitás és hipogonadizmus még nem vizsgálható. Az éhezés utáni glükózszint normális volt mindkét gyermeknél, szemben az egérrel, de a nagyobbikban az éhezési inzulinszint megnövekedett, összhangban az egerek hiperinzulinémiájával és inzulin rezisztenciájával. A másik mutációt egy török család három tagjában írták le (14). Itt a 105-ös kodonban találtak egy mutációt: egy cisztein cserélodött treoninra. Hasonlóan a fent említett esethez, a rendellenes polipeptid nem szecernálódik, így leptinhiány lép fel, hasonló tüneteket okozva, mint a keret-eltolódásos mutáció. A leptin expresszióját elsosorban az energiaraktárak helyzete határozza meg. A transzkripció mértéke egyenes arányban van nemcsak a teljes zsírmennyiséggel, hanem a zsírsejtek méretével is (15, 16). Bár a leptinszint csökken éhezés hatására, és megemelkedik étkezés után, mégsem tekintheto a táplálkozással kapcsolt jóllakottsági faktornak, inkább az energiaegyensúly indikátorának (17). A hormonok közül az inzulin és a glükokortikoidok fokozzák, míg a tesztoszteron és a tiroid hormon gátolják a leptin képzodését (18, 19, 20, 21). A citokinek közül a gyulladási citokinek: TNF-?, IL-1, IL-6 in vitro gátolják a leptin expressziót, ugyanakkor in vivo a TNF-? és az IL-1 indukálják (22) más, pl. LIF, TGF-? citokinekhez hasonlóan (23, 22). Ezen ellentmondás hátterében valószínuleg másodlagos mediátorok állnak. Emellett a placentában a hipoxia, az izomban pedig a glükózamin, a glükóz és lipidek eredményeznek még leptin termelodést (17). A zsírszövetben béta-adrenerg közvetítéssel a hideghatás és a katekolaminok, valamint a troglitazon csökkenti a szintézist (17). 7

8 A leptin fehérje felépítése, szerkezete A leptin molekula egy glikozilálatlan 16 kda-os polipeptid, amely az IL-6 citokin család tagjaival mutat homológiát, azaz az ún. helikális citokinek közé tartozik (24). Két diszulfid hídja a biológiai hatás kifejtéséhez fontos (10), az aktivitás legfobb letéteményese pedig a aminosavak közé eso domén (25) (1. ábra). 1. ábra A leptin molekula térbeli modellje. A fehérje az IL-6 citokin család tagja. Forrás: ( A leptin keletkezése, a bioaktív forma A leptint elsosorban a fehér zsírsejtek termelik, szintézise összefüggést mutat a zsírsejtek méretével (a nagyobbakban több termelodik), a vér leptinszintje pedig a zsírraktárak méretével (17). A zsírszövet által termelt citokinek családjának tagjaként tehát adipokinnek tekintheto. A zsírszövet nem az egyetlen leptin forrás: gyomor mukóza, vázizom, placenta, csontveloi és hipofízis sejtek esetében egyaránt leírtak számottevo mértéku szintézist (17, 26), csakúgy, mint primer oszteoblaszt kultúrákban (27). A termelt polipeptid a véráramba jut, feladatát így jórészt endokrin hormonként fejti ki, de para- és autokrin hatásai is ismertek. A vérplazmában részben plazmafehérjékhez kötve kering, ezek aránya befolyásolja a biológiai aktivitást. Egy tanulmány szerint a sovány személyekben a plazmafehérjékhez kötött leptin aránya nagyobb, mint a kövérekben (28), azaz az elérheto leptin mennyiségét nemcsak a szintézise, hanem a rendelkezésre álló kötofehérjék mennyisége is befolyásolja. Sot mutáció következtében megemelkedhet a vérplazma szolubilis leptinreceptor szintje, amely akár a keringo leptin 80%-t is megkötheti (29). 8

9 A leptint különféle szövetek veszik fel, eltávolítását a vérbol a vese végzi. A veseglomeruloson átszurodo leptint a vesecsatornák hám sejtjei veszik fel és bontják le. Ehhez a sejteken nagy mennyiségben találhatók szignalizációra képtelen csonka receptor formák (17). A fenti megállapításokat támasztják alá a végstádiumú veseelégtelenségben szenvedo betegekben mért magas leptinszintek is (30). A leptin receptora (OBR), jelátviteli utak A leptinreceptort Zhang és munkatársai klónozták 1995-ben egér choroid plexusból expressziós klónozási stratégia alkalmazásával (31). A receptor génje, a db gén (utalva a hiányában fellépo diabéteszre) egérben a 4-es kromoszómán helyezkedik el, 46.7 cm pozícióban, az mrns-e 3393 bp-nyi. Emberben az 1-es kromoszóma 1p32 régiójában található, az mrns mérete 3800 bp. Az emberi fehérjetermék 1164 aminosava kb. 75%-os azonosságot mutat az egér, illetve a patkány fehérjével. A fehérjének számos alternatív hasítással keletkezett izoformája van, amelyek különbözo mértékben képesek jelátvitelre, és különféle funkciókat látnak el. A leptinreceptor szerkezete A leptin receptora az I-es típusú citokin receptor családba sorolható, amelynek tagjai még az IL-2, -3, -4, -6, -7, LIF, G-CSF, GRH, prolaktin és eritropoietin fehérjék receptorai is. A család tagjainak jellemzo motívuma az extracellulárisan négy ciszteint és a WSXWS aminosavakat tartalmazó szekvencia, továbbá különbözo számú III-as típusú fibronektin domének jelenléte (32, 33). Az leptinreceptor extracelluláris régiója négy III-as típusú fibronektin domént és két citokinreceptor domént hordoz (34). Leptin hiányában is homodimereket formáz, aktív állapotba ligand-indukálta konformációs változásokkal kerül (35). Intracellulárisan a teljes hosszúságú receptor számos olyan szekvencia elemet hordoz, amelyek szükségesek a további jelátviteli eseményekhez. Az OBR nem rendelkezik saját tirozin kináz doménnel, ezért citoplazmatikus kinázokat köt, elsosorban a Jak-család (Janus kináz) tagjait. Hasonlóan más citokin receptorokhoz, tartalmaz erosen konzervatív, prolin-gazdag box1 és két kevésbé konzervatív box2, 9

10 illetve box3 régiót (36). A box1 és a box2 domének felelosek a Jak kinázok kötéséért, bár úgy tunik, az OBR esetében csak a box1 és a környezo aminosavak jelenléte is elegendo a Jak aktiválásához (37). Bár a box3 nem szükséges a kinázok toborzásához, a további szignalizációs lépésekben fontos szerepet játszó STAT (signal transducer and activator of transcription) molekulák kötéséhez elengedhetetlen (38) (2. ábra). A leptinreceptor, mivel homodimereket formál és box2 hiányában is van szignalizációs képessége, a GRH receptor alcsalád tagjaihoz sorolható (39). 2. ábra A leptinreceptor szerkezete és izoformái. A fehérje extracellulárisan ciszteingazdag citokinreceptor, intracellulárisan box1, box2, box3 motívumokat tartalmaz. OBR = leptinreceptor, CR= citokinreceptor domén, F-III = III-as típusú fibronektin domén. A leptinreceptor típusai: keletkezésük, elofordulásuk, feladataik A leptinreceptor izoformák közül eddig hatot írtak le, amelyek többsége alternatív hasítással keletkezik a db génrol készült mrns átiratból (40). Elnevezésük rendre OBR-a, b, c, d, e, és f (2. ábra). Valamennyi változat azonos ligandköto 10

11 doménnel bír, és hordozza a jellegzetes extracelluláris 4 cisztein, WSXWS motívumokat (41). Az a-e variánsokat eloször egér agyban írták le, az egyes változatok a C-terminálisban különböznek. Közülük az a-d formák transzmembrán és citoplazmatikus régióval is rendelkeznek, amelynek proximális, box1-t magába foglaló szakasza azonos valamennyi formánál, a további citoplazmatikus régió hossza pedig más az egyes típusokban. Az OBRb jelu a teljes hosszúságú, 301 intracelluláris aminosavat tartalmazó változat, míg az OBRa, OBRc, OBRd izoformáknak csak 34, 32, illetve 40 aminosavnyi sejten belüli szakasza van. Tehát csak a teljes hosszúságú b változat az, amely valamennyi, a szignalizációban fontos régiót hordozza, a fo STAT útvonal csak ezen a formán keresztül aktiválódik, így teljes funkcionalitással csak ez bír. Ezt a változatot elsosorban a hipotalamusz expresszálja, jelezve, hogy a hipotalamusz a leptin hatásának fo terepe (42). A megnövekedett leptinszint receptorszám csökkenéssel járhat együtt, azaz leptinnel szembeni érzéketlenséget eredményezhet. Ez megakadályozhatja a leptint hatásainak kifejtésében, például kövérséget okozhat. Egyre idosödo, késoi elhízásban szenvedo patkányokban csökkeno hipotalamikus OBRb-t észleltek (43), alátámasztva az iménti megállapítást. A hipotalamusz mellett számos más sejt is termel hosszú izoformát, jelen van tüdo, vese, zsír-, endotél- és mononukleáris vérsejteken, a gyomor, izom, máj, hasnyálmirigy-szigetek sejtjein, a sebszélek keratinocitáin, oszteoblasztokon, de az endometriumban, placentában és a köldökzsinórban is megtalálható (17). A rövid izotípusok közül az a változat az, amelyik az agyban nagy mennyiségben fordul elo, feltehetoen a leptin vér-agy gáton átjutását segíti (42). A rövid változatok nagy számban találhatók a vesében is, ahol valószínuleg a plazmaleptin eltávolításában játszanak szerepet. A e formából hiányzik a transzmembrán és a citoplazmatikus rész is, így szolubilis receptorként funkcionál, elsosorban a szívben, hipotalamuszban, zsírsejtekben, herében fordul elo. Úgy tunik, ez a típus nem alternatív hasítással keletkezik, mert mrns változatát nem találták meg (44), ugyanakkor kimutatták, hogy a membránkötött formák ektodomén vedlésével létrejöhet (45). A szolubilis receptor a vérben keringve fontos szerepet tölt be a biológiailag aktív, szabad leptin szintjének beállításában. 11

12 A hatodik, f variánst patkányban írták le, miután annak cdns könyvtárában egy olyan nyitott leolvasási keretre bukkantak, amely erosen homológ volt az egér és emberi OBR-ével, de tartalmazott egy olyan citoplazmatikus domént, amely nem hasonlított egyetlen korábban azonosított formához sem. Szöveti elofordulása szélesköru, csakúgy, mint a többi izoformáé (46). Leptinreceptor mutációk és következményeik A leptinreceptor egyik legrégebben, évtizedek óta ismert mutációja az ún. diabetes C57B1db/db egerekben eloforduló db/db mutáció. (47). Ennél a mutációnál egy G? T szubsztitúció következtében csonkolt forma termelodik, amelybol hiányoznak az aktivitásért felelos részek. Ezekben az egerekben igen magas leptinszint mérheto, de nem képesek rá reagálni. Így az egerek cukorbetegek, leptinre érzéketlenek lesznek, súlyos elhízást, hiperfágiát, metabolikus eltéréseket, hipotermiát, hipogonadizmust mutatnak. Ezen kívül még két mutációt azonosítottak egérben, mindkettot a receptorok valamennyi formájának hiánya jellemzi, vagy legalábbis mennyiségük a kimutathatósági küszöb alatt van. A Zucker (ZDF, Zucker diabetic fatty, fa/fa) patkányok ugyancsak kövérek és cukorbetegek, a problémát itt is egy pontmutáció okozza, amely a membránreceptorok számát csökkenti, míg a Koletsky patkányban a kicserélodés következtében az összes izoforma hiányzik (48). Emberben a leptinreceptor mutációk rendkívül ritkák. Az elso esetet Clement és munkacsoportja hozta nyilvánosságra egy olyan családot vizsgálva, ahol a kilenc gyermek közül három esetében extrém elhízást tapasztaltak, közülük egy 19 éves korában meghalt. A lánygyermekek normál testsúllyal születtek, de már néhány hónap után abnormális testsúlygyarapodást mutattak, feltuno falánkságuk akár ételért folyó harcban is megnyilvánult. A spontán pubertáskori fejlodés elmaradt, nem fejlodött ki noies emlojük, a szeméremszorzetük, hónaljszorzetük, 19 ill. 13 éves korukban még nem menstruáltak, az alap ösztrogén, LH, FSH szintjük alacsony volt. Mindezek centrális eredetu hipogonadizmusra utalnak. A tirotropin és növekedési faktor szintjük is rendellenes volt. Ugyanakkor a db/db egerekre jellemzo hiperglikémia és hipotermia nem kapcsolódott a mutációhoz. A problémát itt is egy báziscsere okozta, aminek 12

13 eredménye egy szolubilis receptorváltozat lett, így a vérben keringo leptin 80%-a kötött, azaz nem hozzáférheto formában volt jelen (29). Jelátviteli utak Az OBR a ligandkötést követoen homodimerjeinek konformációs változásával aktiválódik, és miután nincs belso tirozin-kináz doménje, a citoplazmából köt meg Jak (Janus tyrosine kinase) kinázokat, elsosorban a Jak2-t. A homodimerhez asszociálódott enzimek foszforilálják egymást és a receptor meghatározott tirozin gyökeit, aktiválva magukat és a receptor dokkoló helyeit, ahova további szignalizációs molekulák kötodnek be. A jelátvitel fo útja STAT (signal transducer and activator of transcription) molekulákon keresztül történik, de a MAPK (mitózist aktiváló protein kináz) és az inzulin útvonal (IRS-ken, inzulin receptor szubsztrátokon át) is fontos szerepet játszik a különféle hatások közvetítésében. Sot, eddig még nem teljesen tisztázott módon a zsírsavoxidáláshoz vezeto AMPK/ACC (5 -AMP-activated protein kinase/acetylcoenzyme A-carboxylase) út is aktiválódhat (3. ábra). 13

14 3. ábra Leptin jelátviteli utak. A fo útvonal a Jak-STAT. A kék pötty foszfátcsoportot jelöl. Az elsodleges jelátviteli út a Jak-STAT (48) A leptinreceptor fiziológiás körülmények között a Jak2-t köti, amely egy specifikus tirozin gyök foszforilálásával a STAT család tagjait toborozza a receptorhoz. Elsosorban STAT3-t, de leírták a STAT1, STAT5, STAT6 faktorok aktiválódását is. A foszforilálódott molekulák homo- és heterodimereket képezve a sejtmagba helyezodnek át, ahol APRE, SIE és GAS-szeru reszponzív elemekhez kapcsolódnak. Ezt az utat gátló módon szabályozza a SOCS-3, amely a Jak- foszforilációt akadályozza, és a proteintirozin-foszfatáz-1b (PTP1B), amely a Jak2-t defoszforilálja. 14

15 A leptin a Jak-STAT úton keresztül elsosorban a hipotalamuszban hat amelynek számos, foként a táplálkozással összefüggo régiójában mutattak ki STAT3 aktivitást leptin hatására. Emellett több más sejt- illetve szövettípusban is bekapcsol ez az útvonal, úgymint a gyomor mukózájában, petesejtben, a here csírasejtjeiben, a méhnyálkahártyában. A vérsejtek közül STAT3 aktiválódást figyeltek meg a mononukleáris sejtekben, amely T-sejtek aktiválódásához vezetett, illetve monocitákban proliferációt és citokin termelést indukált. Leptin kezelést követoen a keratinocitákban is STAT3 aktivitást mértek, így valószínuleg a borregenerálódásban is szerepet játszik. A STAT3 aktiválódás gyengülését írták le idos, elhízott rágcsálókban, mind foszforilálódás, dimerképzés, mind pedig a DNS kötodés szintjén. Ennek hátterében az útvonal fokozott gátlása állt, amit a megnövekedett SOCS-3 eredményezett. Az idoskori hiperleptinémiával együttjáró leptin rezisztencia kialakulásához tehát nemcsak a receptor csökkenése, hanem a fo jelátviteli út fokozott gátlása is hozzájárulhat. A leptinhiányos, elhízott ob/ob egerek hipotalamuszában a STAT3 immunreaktivitás csökkent volt, jelezve, hogy a ligand hiánya a szignálmolekulák expressziójára is hatással van. Ugyanakkor a leptin fontos funkciói közül nem mindegyik igényli a STAT3 jelet. Az e szempontból kulcsfontosságú tirozin aminosav kicserélése a receptoron ugyanis nem érinti a leptin reprodukcióban játszott szerepét, és nem okoz olymértéku glükózszint-változást, mint a db/db egerekben. Ez jelzi egyéb útvonalak kiemelkedo szerepét a leptin hatásainak közvetítésében. Leptin által aktivált egyéb jelátviteli utak (48) A leptin feladatainak ellátásában a MAPK (mitogén-aktivált protein kináz) út szintén fontos szereppel bír. A MAPK útvonalat az SHP-2/Grb2 komplex kapcsolja be. A komplex kétféle módon is aktiválódhat: részint a receptor közvetítésével, annak megfelelo dokkoló helyéhez kapcsolódva, vagy közvetlenül a receptor-asszociált Jakok segítségével. Ez utóbbi esetben nincsen szükség a receptor teljes intracelluláris részére, annak csonka formáján keresztül is folyhat a jelátvitel, bár kevésbé hatékonyan. A szignalizációs kaszkád aktiválódását mind in vitro, sejtvonalakon, mind in vivo, hipotalamuszban, májban, zsírszövetben kimutatták. Úgy tunik, a leptin indukálta 15

16 proliferációban, és oszteoblaszt jellegu sejteken indukált apoptózisban egyaránt szerepe lehet ennek az útvonalnak. A leptin és az inzulin jelátviteli útvonalainak kapcsolatáról is gyulnek az adatok, bár korántsem egyértelmu és minden lépésben tisztázott a kölcsönhatásuk. Az inzulin IRS-eken (insulin receptor substrate) keresztül egy foszforilációs kaszkádot indít el, amely végül a glikogén-szintáz és transzkripciós faktorok aktiválásához vezet. Egyelore nem tudni, pontosan milyen szerepe van ebben az útvonalban a leptinreceptornak, vajon a leptin közvetlenül a receptorán keresztül, vagy a folyamatba késobb bekapcsolódó molekulák révén befolyásolja az inzulin utat. Mindenesetre valószínuleg ezt az utat keresztezve csökkenti a leptin a camp (ciklikus adenozin-monofoszfát) szintet, és fejti ki így a májban az inzulinhoz hasonló, glukagon-antagonizáló hatását, illetve az inzulinkiválasztás csökkenését a hasnyálmirigyben. Ugyancsak nem tisztázott, milyen módon szól bele a leptin a lipid metabolizmust befolyásoló AMPK/ACC jelátviteli folyamatba, amely végül zsírsav oxidációhoz vezet. Zsírsejtekben úgy tunik, ezt a folyamatot a STAT3 faktor segítségével indukálja, azaz szükséges az intakt receptor. A leptin tehát multifunkcionális citokinként számos feladatot ellát, amelyet több útvonalon át, más utakkal keresztezodve közvetít. A teljes útvonalhálózat felderítése ugyan még messze van, de a leptin kölcsönhatásait vizsgálva megkerülhetetlen a legfontosabbak alapszintu vizsgálata. A leptin hatásai A leptin és szerepe az elhízásban, az energia-homeosztázis és az anyagcsere szabályozásában A leptint eleinte antiobezitás hormonként tartották számon, hiszen felfedezése is épp egy olyan mutációt hordozó egértörzshöz kapcsolódott, amelynek legszembetunobb fenotípus bélyege a nagymértéku elhízás volt. A leptin génre homozigóta mutáns alléleket hordozó ob/ob egerek rekombináns leptin hatására veszítettek testtömegükbol (12). Mind az ob/ob, mind a db/db egerekben a súlyos kövérség állapotát hiperfágia, 16

17 csökkent energiafelhasználás, fokozott zsírfelhalmozódás jellemezte. Ezek a tulajdonságok rávilágítanak a leptin központi szerepére az energiaháztartás egyensúlyának fenntartásában a táplálékfelvétel, energiaraktárak és az energia-leadás szabályozásával. Ugyanakkor a db/db egerek magas leptin szintje és a súlyos elhízással együttjáró hiperleptinémia jelzi, hogy a termelt leptin mennyisége önmagában nem jelenti az étvágy- és testsúlycsökkento szabályozókör megfelelo muködését. Az iménti esetekben a leptin nem tudja kifejteni hatását, azaz a szervezet leptinre érzéketlenné válik, amelynek hátterében a szignalizációs események tárgyalásánál említett tényezok, mint például a receptorszám csökkenése vagy éppen hiánya, a kinázgátló SOCS-3, illetve a defoszforiláló PTP1 aktivitásának növekedése állhat. Mivel a leptin termelése elsodlegesen a zsírsejtekhez kötött, és szintézisének mértéke egyenesen arányos a fehér zsírszövet mennyiségével, sot a zsírsejtek méretével is, azaz a fokozódó zsírosodás fokozza a leptin keletkezését is, a leptint inkább egyféle liposztát ellenorzo molekulaként lehetne jellemezni (49). Vagyis a leptin leginkább arra ügyel, hogy a liposztát beállított értéke, tehát a beállított testtömegérték ne változzon: fokozott táplálékfelvétel hatására a növekedésnek induló zsírraktárak több leptint termelnek, amely a táplálékfelvétel csökkenését, nagyobb energiafelhasználást és csökkent étvágyat eredményez. Elsodleges élettani szerepe tehát nem az elhízás megelozése, ahogy azt korábban állították, noha elsodleges fontosságú az elhízással szoros összefüggést mutató energia-homeosztázis szabályozásában. A leptin ezen szabályozó hatását elsosorban a hipotalamuszon keresztül fejti ki, amely az energia-homeosztázis legfobb effektor szerve. Leptinérzékeny idegsejtek találhatók a dorzomediális, ventromediális hipotalamusz és a nucleus arcuatus területén, azaz olyan helyeken, ahol egyéb, a táplálékfelvételt, étvágyat és az energiaegyensúlyt befolyásoló neurotranszmitterek termelodnek (50). Kimutatták, hogy a leptin gátolja az orexigén, és serkenti az anorexigén neuropeptidek termelodését (51). A leptinrezisztens elhízás szélesköru elofordulása utalhat arra, hogy boség idején az energiaraktározás képességének hiánya elonytelen lehet. E nézopontból a leptinnek kiemelkedo szerepe az energia-homeosztázisban az lehet, hogy segít adaptálódni az éhezéshez (52). Az éhezés összetett folyamatot indít be a túlélés érdekében, ennek egyik szabályozó eleme a leptin. Az éhezés csökkenti a leptinszintet, amely úgy tunik, fontos 17

18 az adrenális glükokortikoidok és az étvágy növekedésében, a tiroid és a gonadális hormonok csökkenésében, továbbá az immunrendszer elnyomásában (17, 53). Bár a leptint eleinte antiobezitás hormonként emlegették, mára ez a szemlélet idejétmúlttá vált, tovább bovült és elotérbe került a leptin lipidmetabolizmusban játszott központi szabályozó szerepe. Unger antilipogén hormonként utal a leptinre, hangsúlyozva a molekula azon képességét, hogy megakadályozza a túlzott nemoxidatív-zsírsav metabolizmust, és így védelmet biztosít a lipotoxicitás ellen. Ez a sejtek lipidtúlterhelésbol adódó életképesség- és funkciócsökkenését, súlyosabb esetben életés funkcióképtelenségét jelenti (54). Elsosorban a hasnyálmirigy béta-sejteit érinti a probléma: leptinre receptormutáció következtében érzéketlen Zucker-patkányok bétasejteiben szeres triglicerid szintet mértek, amely lipoapoptózishoz, a béta-sejtek elvesztéséhez és így cukorbetegség kialakulásához vezetett (55). A leptin és a glükóz-homeosztázis, a leptin szerepe diabéteszben Az elhízás gyakran összefügg az inzulinrezisztencia és a cukorbetegség kialakulásával. Így a leptin mint az ob gén terméke, és mint a testtömeg egyik fo szabályozója rögvest az inzulinnal foglalkozók figyelmének középpontjába került mint az inzulin termelodését és hatását befolyásoló újabb tényezo. A feltevést erosítette a leptinhiányos ob/ob és a leptin jelátvitelre képtelen db/db egerekben megfigyelt hiperinzulinémia, inzulin-rezisztencia és diabétesz (47, 56). Azonban az erofeszítések, hogy a leptin diabetikus vagy antidiabetikus szerepét tisztázzák, ellentmondásos eredményekre vezettek. Számos tanulmány erosítette meg, hogy a leptin kezelés fokozza az inzulin-érzékenységet mind egészséges, mind cukorbeteg patkányokban (57, 58), illetve, hogy a cukorbeteg fenotípust korrigálta ob/ob egerekben (59). Ugyanakkor több cikk arról írt, hogy a leptin rontotta az inzulin hatását, pl. humán májsejtvonalon, patkány adipocitákon és vázizomsejteken is, humán vizsgálatok pedig negatív korrelációt mutattak a napi leptin ciklus és a napi inzulinérzékenység között. Továbbá, a leptin koncentráció magasabb az inzulinrezisztens, mint az inzulin-szenzitív férfiakban, függetlenül a zsírmennyiségtol (60). A leptin és az inzulin kapcsolata tehát sokrétu, összetett, így érdemes a szerepét az inzulin-szenzitivitás és az inzulin célszöveteire gyakorolt hatásai alapján vizsgálni. 18

19 Normál, azaz nem elhízott és nem diabéteszes állatmodelleket vizsgálva nem egyértelmu a leptin glükóz-homeosztázisra gyakorolt hatása. Patkányokat leptin infúzióval kezelve mindhárom esetben megnövekedett inzulinérzékenységet észleltek, amelyet megnövekedett glükózfelhasználás jellemzett (60). Hasonlóan egérben is, intravénás (iv) és intracerebroventrikuláris (icv) leptin adagolás hatására a glükózfelvétel és glükózforgalom fokozódott, ugyanakkor a máj glikogéntartalma csökkent (61). Ezzel szemben egy másik csoport nem talált változást patkányoknak adott icv leptin infúziót követoen a perifériás glükózfelvételben, glikolízisben és glikogén szintézisben, bár a máj glükózfluxusában változást figyeltek meg (62). Meglévo cukorbetegség esetén a leptin többnyire hatásosnak bizonyult az inzulin-érzékenység helyreállításában. Streptozotozinnal inzulinhiányos, cukorbeteggé tett patkányokban a leptin helyreállította a glükózszintet és normalizálta a perifériás inzulin-érzékenységet (58). Magas zsírtartalmú diétával indukált elhízás esetében a leptinkezelés javította a csökkent glükóztoleranciát és a vázizom glükózfelvételét (63). Ugyanakkor elhízott személyeknek adott leptin ugyan csökkentette a testsúlyt, de nem befolyásolta a cukorkontrollt és az inzulinhatást (64). Mindazonáltal fontos megjegyezni, hogy a súlyos elhízás gyakorta leptin rezisztenciát okoz, akár receptor, akár a jelátvitel késobbi szintjén hatva, így ilyen esetekben a leptinkezelés nem is lehet hatásos. Kongenitális, általános lipodisztófiában szenvedo betegek inzulinrezisztenciát, hiperglikémiát, hiperinzulinémiát mutatnak és nagyon alacsony a leptin szintjük (65). Elozetes eredményekbol úgy tunik, a leptin génterápia ígéretes lehet a metabolikus rendellenességek megszüntetésére ezekben a betegekben (66). Az inzulinhatás elsodleges célszövetein, a máj-, vázizom- és zsírsejteken egyaránt megtalálható a leptinreceptor, utalva arra, hogy a leptin közvetlen hatást is gyakorolhat ezekre a szövetekre. A májban úgy tunik, a leptin fokozza az inzulinérzékenységet. Leptin jelenlétében a máj glikogénszintézise megemelkedett ob/ob egerekben, de hasonlót tapasztaltak sovány egerekben is. Patkány májsejteken pedig csökkent glükoneogenezist figyeltek meg (60). Molekuláris szinten a leptin fokozta in vivo a máj inzulinreceptor aktivitását (67), ennek azonban ellentmond néhány in vitro, sejtvonalakon elvégzett kísérlet, amelyek során nagy koncentrációban adott leptin gátolta az inzulin jelátvitelt (60). A vázizomban mind in vitro, mind in vivo leírták a leptin glükózfelvételt serkento hatását, de itt is világot látott néhány olyan tanulmány is, 19

20 amelyben nem találtak hatász, bár a kísérleti körülmények jelentosen különböztek az egyes esetekben (60). Zsírsejteken sérült inzulin jelátvitelt (68) és csökkent inzulinérzékenységet: csökkent glükózfelvételt, gátolt glükózbeépülést tapasztaltak. Eltéroen viselkedik a barna zsírszövet: ott leptin hatására fokozott glükózfelvételt figyeltek meg (60). A hasnyálmirigy béta-sejtjeiben pedig a leptin egyértelmuen gátolja az inzulinszintézist (69), emellett ugyanakkor véd a lipoxicitás eredményeként bekövetkezo sejthaláltól és az így kialakuló diabétesztol (54). Röviden összefoglalva tehát úgy tunik, a leptin bizonyos esetekben alkalmas lehet az inzulinrezisztencia és a diabétesz enyhítésére, amennyiben képes fokozni az inzulin-érzékenységet, ugyanakkor óv a túlzott inzulintermeléstol. A leptin és a csont, a leptin szerepe az oszteoporózisban Az elmúlt években felmerült a leptin szerepe a csonttömeg szabályozásában is. Azonban csakúgy, mint a diabétesz esetében, itt is meglehetosen ellentmondásos eredmények láttak napvilágot, így egyelore nincsen világos képünk arról, hogy pontosan milyen szinteken és foleg milyen mértékben, milyen mechanizmussal befolyásolja a leptin a csonttömeg alakulását. Egyes csoportok adatai szerint a leptin erosen gátolja a csontképzodést. Az már korábban is ismert volt, hogy a népbetegségnek számító oszteoporózis kevésbé fenyegeti az elhízott embereket, míg a rendellenes ivari muködés eloidézheti azt. A leptinhiányos ob/ob és a leptinrezisztens db/db egértörzsekre egyidejuleg jellemzo az elhízás és a hipogonadizmus, amivel erosen megemelkedett csonttömeg párosul (70). Vagyis a szabályozó mechanizmus ebben az esetben felülírja a hipogonadizmusból adódó csontvesztést. Természetesen a hangsúly a leptin szerepére terelodött, amit megerosített az a megfigyelés is, hogy a leptin centrális adagolása a mutációt hordozó egerekben normalizálta a csonttömegeket, míg a vad típusúakban csontvesztést indukált (70). Kiderült, hogy a folyamat független a kövérségtol is. Az ob/ob egereket ugyanis alacsony zsírtartalmú diétán kosztoltatva elhízásuk lelassul, eleinte még normális tömeguek, de a megnövekedett csonttömeg már ekkor is jellemzo, sot a szintén nem elhízott heterozigótákban is megfigyelheto. Sejtszinten a jelenség hátterében fokozott oszteoblaszt muködést figyeltek meg, de a funkcióképes leptinreceptor jelenlétét nem 20

21 tudták kimutatni, ami centrális szabályozásra utalt (70). Az anorexigén peptidek közvetíto szerepét, illetve az endokrin és a lokális hatást kizárták, bebizonyosodott, hogy a leptin a szimpatikus idegrendszer béta-adrenerg rendszerének közvetítésével fejti ki csontképzodést gátló szerepét (71). A leptinhiányos egerekre a szimpatikus idegrendszer csökkent aktivitása jellemzo (72), de a munkacsoport feltevését alátámasztják azok a vizsgálatok is, miszerint szimpatomimetikumok csontvesztéshez vezetnek, illetve béta-adrenerg antagonisták fokozzák a csontképzodést (73). Napvilágot láttak azonban olyan eredmények is, amelyek szerint a leptin elosegíti a csontképzodést. Thomas és munkacsoportja (74) azt tapasztalta, hogy leptin hatására a humán csontveloi sztróma sejtek differenciálódása eltolódik oszteoblaszt irányba, miközben a zsírsejt irány gátolt lesz, míg más adatok arra utalnak, hogy a leptin képes gátolni az oszteoklaszt képzodést (75). Hasonlóan, a leptin csökkentette az ovariektómia-indukált csontvesztést patkányokban (76). Sot Steppan és munkatársai (77) ob/ob egerekben rövidebb femurméretet figyeltek meg, amely intrapritoneális leptin injekcióval jelentosen javítható volt. Ezzel szemben vannak olyan molekuláris szintu adatok, amelyek szerint a leptin fokozza az apoptózist humán csontveloi sztrómasejteken (78). A kép tehát meglehetosen ellentmondásos, egyes tanulmányok szerint a leptin gátolja a csontképzodést a szimpatikus idegrendszeren keresztül, míg mások szerint a leptin elosegíti a csontképzodést lokális hatásai révén. A leptin és a nem Már az elso humán leptin mérésekbol nyilvánvalóvá vált, hogy ugyanakkora testtömegindex mellett is a nok vérében 2-3-szor nagyobb a leptin koncentrációja, mint a férfiakéban (79). Ez összefügg a két nem eltéro testösszetételével, a nokben átlagosan nagyobb a zsír százalékos aránya, mint a férfiakban, és mivel a leptin mennyisége korrelál a zsírmennyiséggel, így a tapasztalt eltérés nem meglepo. Ez a különbség már gyerekekben, sot újszülött köldökzsinórvérben is kimutatható, de igazán jelentossé a pubertás kezdetével válik (80, 20). Tehát a zsírszövet mennyisége mellett más faktorok, például nemi hormonok is jelentosen befolyásolják a vér leptin koncentrációját. 21

22 A pubertás kezdetekor a hipotalamusz-hipofízis-gonád tengely aktiválódását a leptin képes kiváltani. Az már régóta ismert, hogy lányoknál a testzsírnak egy bizonyos százalékos értéket el kell érni ahhoz, hogy az elso menstruáció bekövetkezzen. A leptin ennek jelzésére kiváló lehet, hiszen termelodése szorosan összefügg a testzsír tartalommal. Ezt alátámasztja, hogy sovány, amenorrheás noi sportolókban nagyon alacsony a leptinszint, továbbá leptinhiányos ob/ob egerekben szintén hipogonadizmus tapasztalható (26). Sot, a nostény egerek sterilek, amely helyreállítható leptin kezeléssel, míg a hímek képesek ugyan reprodukcióra, de csak bizonyos diéta mellett (81). A humán tapasztalatok is egybevágnak a rágcsáló megfigyelésekkel: a serdülokor kezdetekor a lányokban ugrásszeruen megemelkedik a leptinszint (82). Érdekes adatokkal szolgálnak azok a ritka esetek, amikor mutáció következtében a betegben nem termelodik a leptin. Bár nagyon kevés ilyen van, egy no 34 éves korában még amenorrheás volt, míg egy 22 éves férfi hipogonadizmusban szenvedett (14). A terhesség alatti drámai események része a rövidtávú hízás, megnövekedett zsírraktárak, és egyéb hormonális, metabolikus változások. A terhesség alatt a szérum leptin szintje megemelkedik, ami a terhességgel együtt járó súlygyarapodás következménye, korrelál a testtömegindex-szel (83, 84), bár a terhesség késoi szakaszában a placenta és a magzat is termel leptint (26). A szülés után a vér leptin koncentrációja lecsökken (85). Egyéb funkciók Az elhízás szoros összefüggést mutat a kardiovaszkuláris okokra visszavezetheto halálozással (részben magas vérnyomás kialakulásának következtében). Így természetesen megvizsgálták a leptin esetleges szerepét a hipertenzió létrejöttében is. A leptin túlzott termelodése, illetve krónikus leptinkezelés vérnyomás-növekedést eredményez. Úgy tunik, a leptin ezen hatása indirekt, elsosorban a szimpatikus idegrendszer aktiválásán alapul, amirol már korábban is szó esett (86). A leptinnek fontos szerepe lehet az egyedfejlodésben is, minthogy receptora nagy számban megtalálható szerte a magzati szövetekben. Valószínuleg befolyásolja az agy fejlodését is, hiszen az ob/ob és a db/db egereknek csökkent az agytömege, 22

23 szerkezeti idegi rendellenességeik vannak, károsodott a mielinizáció, és hiányt szenvednek számos neuronális és glia sejtekre jellemzo fehérjében (17). Emellett a leptin serkenti a vérképzést, mégpedig receptorával egy új utat megnyitva, amely valószínuleg az ossejt/progenitor sejtek proliferációjára hat. Ez az út a normális limfocitaképzéshez szükséges, és feltehetoen az vörösvérsejtképzést is befolyásolja, különösen anémiás állapotban (87). Ezenkívül a mielocita progenitor sejtek osztódását is stimulálja (88). A hematopoietikus progenitor sejtek mellett a leptin fokozza a T-limfociták proliferációját és gátolja bennük az apoptózist. Emellett serkento hatást gyakorol a monocita/makrofág aktiválódásra, az immunsejtek citokintermelodésére, az angiogenezisre, és a sebgyógyulásra is (89). Sot a leptin összeköti a proinflammatorikus Th1 immunválaszt a táplálékfelvétellel és az energiaegyensúllyal, a táplálékhiány következtében lecsökkent leptinszint csökkenti az immunrendszer kapacitását (90). Amint a fentiekbol is kiderül, a leptin funkcióiról kialakult képünk ma már jóval összetettebb, semmint hogy pusztán antiobezitás hormonként tekintsünk rá. A testtömeg, zsírraktárak és az energiaegyensúly szabályozását számos más, alapveto élettani folyamattal köti össze, így mintegy karmesterként hangolja össze ezen folyamatok regulálását. A zsírszövetet tehát többé nem tekinthetjük indifferens szövetnek, az ott termelodo molekulák aktívan vesznek részt a szervezet összehangolt muködésének megteremtésében. Zsírszövet: a fibroblasztszeru sejtektol az endokrin szervig Az leptin felfedezésével a zsírszövet új megvilágításban került a figyelem középpontjába. A korábbi feltevés szerint a zsírszövet nem volt más, mint inert, térkitölto szövet, amelynek legfobb feladata az energiaraktározás. Hosszú évekig tartotta magát az a nézet, hogy ha az energiafelvétel meghaladja az energiafelhasználást, akkor a fölösleg passzívan tárolódik a zsírsejtekben, valahogy úgy, mint ahogy az üzemanyagot tároljuk óriási tartályokban. Az elhízás elmúlt évtizedekben tapasztalt terjedése, és foként az ezzel együtt járó betegségek azonban a kutatók érdeklodését a zsírszövetre irányították. Mára bebizonyosodott, hogy a fibroblasztszeru sejtekbol 23

24 differenciálódó zsírszövet nemcsak a metabolikus folyamatoknak résztvevoje, hanem az általa termelt hormonok, citokinek révén az életmuködések szabályozásában, összehangolásában is aktív szerepet játszik, azaz endokrin szervnek is tekintheto. Adipogenezis: a fibroblasztszeru sejttol az érett zsírsejtig A fehér zsírszövet differenciálódása mezodermális sejtekbol már a születés elott megindul, azonban eredetérol és azokról a molekuláris eseményekrol, amelyek az embrionális ossejt prekurzor zsírirányú elkötelezodését eloidézik, még meglehetosen hiányos ismeretekkel rendelkezünk. Annyi bizonyos, hogy a mezodermális ossejtprekurzor képes adipocita, kondrocita, oszteoblaszt és miocita irányban differenciálódni (91). Becslések szerint a zsírdifferenciálódás során lezajló strukturális és funkcionális változásokban mintegy 300 fehérje érintett (92), amelyeknek egy része transzkripciós faktorként a folyamat levezénylésében segédkezik. Egy nemrégiben végzett génlapka vizsgálat 1600 gén expresziójának változását mutatta, közel fele nott, fele csökkent (93), míg proteom-analízissel több mint 2000 fehérje profilja változott meg (94). Az adipogenezis tanulmányozására számos modell áll rendelkezésre zsírirányba elkötelezett sejtvonalaktól kezdve zsíreredetu, illetve embrionális fibroblaszt eredetu preadipocita primer tenyészetekig. A folyamat fobb szakaszai azonosak, de érdemes megjegyezni, hogy a különbözo modellek viselkedése nagyon eltéro lehet, így se szeri, se száma a különbözo indukciós koktéloknak, és nincsen tehát általános protokoll sem. A növekedési fázisban levo sejtek akár sejtvonalból, akár primer tenyészetbol származnak, morfológiailag fibroblaszt jelleguek, ám már elkötelezettek zsírirányba. Elkötelezodés hiányában az indukció és így a differenciálódás nem váltható ki, mint például az egyik legkedveltebb egér fibroblaszt sejtvonalban, az NIH-3T3-ban sem. A konfluens állapotot elérve a sejteknek ki kell lépni a sejtciklusból ahhoz, hogy a zsírsejtté történo átalakulás megindulhasson. Sokáig úgy tartották, hogy a konfluens sejtek kontakt gátlása az, ami leállítja a növekedést, de úgy tunik, nem maga a konfluencia és a sejt-sejt érintkezés felelos ezért (95). Annyi bizonyos, hogy 24

25 molekuláris szinten a C/EBP? és a PPAR? (peroxiszóma-proliferátor-aktivált receptor?) transzkripciós faktorok egyaránt érintettek a növekedés leállításában, és az zsírsejtspecifikus gének transzaktiválásában. Bár a két faktor mennyisége a differenciálódás folyamata során no meg igazán, valószínuleg a jelenlévo kevesebb mennyiség is elég ahhoz, hogy a növekedést gátolja (91). A növekedés leállása után a preadipocitáknak megfelelo mitogén és adipogén jelek kombinációját kell kapniuk, hogy a további lépések folytatódjanak, és a zsírsejtre jellemzo morfológiai és biokémiai markerek megjelenjenek rajtuk. Az indukciós koktél hatására nyugalmi szakasz után a sejtek még legalább egy osztódáson mennek keresztül: ez az úgynevezett klonális expanzió. Bár ez sokáig szükséges lépésnek tunt, mára fontossága megkérdojelezodött. A 3T3-L1 sejtek ugyanis képesek differenciálódásra mitogén-aktivált-kináz inhibitor jelenlétében; sem a DNS szintézis, sem a mitotikus expanzió nem szükséges a differenciálódáshoz (96). Egy másik vonalon pedig kimutatták, hogy az S-fázis gátlása megakadályozza a PPAR? szintézisét és így a lipogenezist, míg G2/M inhibitorok megakadályozták a mitózist, de nem a PPAR? szintézist és a lipogenezist (97). Úgy tunik, a klonális expanzió során más az osztódást szabályozó faktorok mintázata, azaz itt nem a prekonfluens sejtekre jellemzo osztódásról van szó. A retinoblasztóma fehérjék közé tartozó p107 expressziójának átmeneti emelkedését figyelték meg ebben a fázisban, ami nem jellemzo a szérumindukált növekedésre. Emellett más a gas (growth arrest-specific) gének mintázata is: a gas6 gén jellemzoen csak a klonális expanzió során fejezodik ki (91). A foszfatáz inhibitor H2 szintézisének tranziens növekedése pedig arra utal, hogy egy foszforilációs-defoszforilációs mechanizmus is érintett a folyamatban (98). A következo lépésben a génexpressziós mintázat drámai változása jelzi a differenciálódás megindulását, amelyet biokémiai markerek és morfológiai markerek megjelenése kísér. A differenciálódás megindulása egy transzkripciós faktorokból álló kaszkádot indít be, amelynek fobb szereploi igen, pontos mechanizmusa és valamennyi résztvevoje azonban nem ismert. A folyamat kezdetén az ADD1, SREB-1c és a C/EBP?,? expressziója hirtelen megno, akárcsak a PPAR?-é. Ezt követi a C/EBP? és PPAR? expressziójának a fokozódása (99). Bár a C/EBP? a differenciálódás kezdetekor rögvest indukálódik, DNS-kötodése késleltetett. ChIP (chromatin immunoprecipitation) 25

26 analízissel kimutatták, hogy kb. 24 óra múlva kötodik a PPAR? és a C/EBP? génjeinek promóteréhez. A C/EBP? ezután újabb késleltetést követoen hozzákötodik a saját, a PPAR? és a 422/aP2 promóterében található válaszadó elemhez, amellyel valószínuleg az említett gének expressziójának fennmaradását biztosítja (100). Emellett még a CREB és a GATA transzkripciós faktorok játszanak kulcsfontosságú szerepet a differenciálódás megindulásában. A GATA-2, -3 faktorok kifejezodése specifikus a preadipocitákban, és a differenciálódás alatt mrns szintjük lecsökkent. Tartós expressziójuk preadipocita stádiumban tartja a sejteket. A GATA fehérjék hatásukat adipogén elemek, például a PPAR? promóterének gátlásával fejtik ki, így afféle ajtónállóknak tekinthetok, akik eldöntik, hogy a sejt beléphet-e a differenciálódás fázisába vagy sem. Az még vizsgálat tárgya, hogy a sejtek elkötelezodésében van-e szerepük (101). A másik nélkülözhetetlen transzkripciós faktor, a CREB aktiválódását a camp szint emelkedése váltja ki. A CREB konstitutívan expresszált az adipogenezist megelozoen és annak során is, az indukciós koktél pedig fokozza az aktivitását. A CREB túltermeltetése 3T3-L1 sejtekben szükséges és elégséges az adipogenezis kiváltásához, továbbá domináns-negatív CREB túltermeltetése önmagában megakadályozza a zsírdifferenciálódást indukciós koktéllal kezelt sejtekben is (102). A transzkripciós faktorok mellett még egyéb szignalizációs molekulák is részt vesznek a differenciálódás szabályozásában, úgymint a pref-1 (preadipocita faktor-1) és a wnt család bizonyos tagjai. A pref-1 szintén a preadipocita fenotípus fenntartásában érdekelt, mennyisége drámaian lecsökken a differenciálódás során, érett zsírsejteken pedig nincs jelen (91). Sejtszinten a korai eseményekhez tartoznak az extracelluláris mátrix elemeinek változásai, a csökkent aktin és tubulin termelodés, az elnyúlt sejtalak legömbölyödése is (91). A zsírsejt-differenciálódás késoi eseményei többnyire morfológiai, biokémiai változásokat jelentenek. A de novo lipidszintézis jelentosen megno, a lekerekedett sejtekben megjelennek a lipidcseppek. Az ehhez szükséges enzimek szintézise akár százszorosra is nohet. Biokémiai markerként megjelenik többek között az ap2/422, CD36, GLUT4 és a perilipin fehérje. A differenciáció során a? 1-adrenerg receptorok 26